荧光定量PCR基础知识课件.pptx
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- 荧光 定量 PCR 基础知识 课件
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1、荧光定量PCR基础纲纲要要定定量量 PCR 介绍介绍荧光定荧光定量量PCR化学原理化学原理 仪器仪器的的校正校正定量定量PCR实实验验要素要素数据分析数据分析定量定量PCR常常见见故障故障排排查查常见应用常见应用定定量量 PCR 介绍介绍什么什么是荧光定是荧光定量量PCR指在指在PCR反应体系中加反应体系中加入入荧光基团荧光基团,利利用荧光信号用荧光信号积积累实时监测累实时监测整整个个 PCR进进程,使每一个循程,使每一个循环环变得变得“可见可见”,最后通最后通过过Ct值值和和标准曲标准曲线线对样对样 品中品中的的DNA(or cDNA)的起始浓度进行的起始浓度进行定定量的方法。量的方法。定定
2、量量PCR体系体系 普通的PCR体系 模板,引物,dNTPs,buffer,Taq酶 加入各种类型的荧光染料定定量量PCR原理原理 与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行 理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍 每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强光学结构简图典型的PCR四阶段平台期线性增长期指数增长期基线期PCR理论方程 N=N0 x(1+e)nN=产物分子数N0=起始分子数 E=扩增效率 n=循环次数PCR方程只在指数期成立荧荧光光PCR信信号号方程方程什么是阈值阈值 高于背景荧光强度的值被确定为阈值 控制
3、在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉 点确定CT 值。线性图谱半对数图谱CT值由阈值确定Threshold(阈值)CTCT值值:C代表Cycle,T代表阈值(threshold),CT值的含义是:每个反应 管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。数学数学关系关系 Log浓浓度度与与Ct呈线性关系,呈线性关系,根根据样品扩增据样品扩增达达到阈值的循到阈值的循环环数就可计算出数就可计算出 样品样品中所含的模板中所含的模板量量。定定量量PCR的的优优点点1.敏感度:可以检测低拷贝的目的基因。典型的单拷贝检测(如果有足 够的 重复运行,泊松分布显示63%有扩增)2.高分辨率:
4、1倍分辨率3.动力学范围宽:约9个数量级.4.快:节省时间和劳力(不需要跑胶).5.安全:不用EB或放射性物质荧光荧光定量定量PCR化学原理化学原理两种化学方法探针法探针法染料法染料法Taqman探探针法原理针法原理完整的探针:5端荧光基团吸 收能量后将能量转移给临近的3 端荧光淬灭基团(发生荧光共振 能量转移,FRET)退火,探针与模板结合,引物 在聚合酶作用下进行延伸反应,遇到探针时发挥3-5外切酶活性 将探针切碎到反应体系中报告基团与淬灭基团距离变大,在激发光的作用下发荧光TaqMan探探针针设计要点设计要点TaqMan ProbePrimer尽可能地靠近上游引物(一般10个以内),最好
5、是 探针的5端离上游引物的3 有1个碱基。PCR产物大小建议50-150bpGC含量30-80%,避免发卡结构和二聚体Tm值:68-70Tm值:58-60Probe长度:13-25bp(TaqMan MGB Probe)13-30bp(TaqMan Probe)Primer长度:20bp终浓度:0.20.25uM终浓度:0.2uM0.5uM3端的前4个碱基不能有3个以上的G3端的前5个碱基不能超过2个C/G避免重复序列:避免序列中4个以上的G或连续6个A选择C比G多的链当探针5端第一个碱基不能为G,如为FAM,则第二个碱基 也不能是G。5 端染料最好连接在T或C碱基上。MGB探针探针R:荧光报
6、荧光报告基团告基团 NFQ:非荧:非荧光淬光淬灭灭基团基团MGB:小沟结:小沟结合物合物(增加增加探探针针Tm值)值)MGB探针的优势 提高信噪比没有背景荧光 更高的淬灭效率 提高TmTm值15 mer 提高18探针更短只要13-19个碱基 更多一重PCR(淬灭基团不占通道)需要与模板序列完全匹配才可以结合(适合检测SNP)兼并、探针量高的情况也可结合染料染料法原理法原理 SYBR Green I是一种DNA小沟 结合染料 游离时不发光 与DNA结合时发光 每一轮反映结束后收集荧光,检 测体系中双链产物的量。溶解溶解曲线曲线:derivative view反映结束后,温度逐步提升,双链产物在某
7、一温度区域变性为单链,双链结合 染料脱离出来,成为不发荧光的游离态。这一过程检测到的荧光值迅速降低,其 监测值曲线即溶解曲线,不同产物的因其不同Tm值,会产生不同的溶解曲线峰。两种两种方法的比较方法的比较 优势更特异不需要考虑二聚体可以进行多重反应不需要优化拥有已开发的试剂盒 不足比较昂贵 优势比较便宜 不足特异性差需要做融解曲线不能进行多重反应需要进行优化须根据自行设计实验TaqManSybr Green I淬灭基团淬灭基团种类种类荧光报告荧光报告基团种类基团种类DABCYL6-FAM,TET,JOE,HEX,Cy3等等TAMRA6-FAM,TET,JOE,HEX等等BHQ16-FAM,TE
8、T,Cy3,JOE,HEX等等BHQ2Cy3,Texas Red,Cy5,TAMRA,ROX等等BHQ3Cy5,Cy5.5等等报告报告集团及淬灭基集团及淬灭基团团的选的选择择vic不同不同滤光片对应的滤光片对应的发发光集团光集团 滤光片 7000和7300荧光定量PCR系统 7500荧光定量PCR系统 ASYBRGreen I,FAM dyesSYBRGreen I,FAM dyes B VIC,JOE dyes VIC,JOE dyes C NED,TAMRA,NED,TAMRA dyes CY3 dyes D ROX dye ROX,Texas Red dyes E CY5 dye仪器仪器
9、的校正的校正5 仪器的维仪器的维护护和和校正校正误误差差 来来源源定义定义 纯荧纯荧光光谱:光光谱:标准荧光的光谱组分是用于荧光定量分析。ROX,SYBR,FAM,VIC,这些信息存储于计算机中,在数据分析的时候使用。荧光 基团在PCR反应中与纯荧光比较得到准确的荧光计量。原始光谱视图(Raw Date):显示PCR反应中荧光信号的软件视图 背景组分:仪器基座的背景“噪音”。背景噪音影响反应的灵敏度。背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除纯荧光校正 纯荧光校正根据一系列荧光标准品收集荧光数据 软件将不同纯荧光标准品的荧光信息分析并存储到程序中 每次实验运行中,SDS 软件接收原始光谱信号。
10、软件将原始光谱与纯荧 光文件中包含的纯荧光标准进行比较,以确定样本中使用的每一种荧光 的光谱表现纯染纯染料光谱料光谱FAMTAMRAVICROXNEDSYBR GreenROI校正 ROI(Regions of Interest)校正用于生成目标区数据。由于定量PCR仪使用一组滤光片分离检测运行期间生成的荧光能量,所以必 须为每个滤光片生成校正图像,以修正光学系统中的微小差异。校正期间生成的数据,允许SDS 软件映射样本块(Block)上反应孔的位置,从而在仪器操作期间,使软件可判断出反应板上特定反应孔中荧光强度的增量。背景背景校正校正 背景校正程序测量定量PCR仪的环境荧光强度 在运行校正程
11、序期间,定量PCR 仪在 10 分钟内 连续地读取背景校正 反应板的荧光强度,运行温度为 60 随后,SDS 软件计算运行期间所收集到的荧光强度的平均值,提取出 结果并保存到校正文件中 软件在今后的分析中将自动调用此校正文件,从实验数据中减去背景信 号加热槽荧光污染的判断 执行背景校正,当背景荧光信号异常(强度超过72000或7500的滤 光片E超过90000)时 实验中,连续出现不正常的偏高信号,并表明可能存在荧光物质污染时,需要清除热槽中的污染清除热槽中的污染 清洁样本块中污染的反应孔a.用移液器吸取少量水或乙醇并滴入 每个污染的反应孔中。b.吹打数次。c.将废液吸入废液杯中。重复以上步骤
12、:乙醇三次,去离子 水三次 确认反应孔中的残留液体蒸发完确认已除去热槽中的荧光污染物 运行背景校正板,确认污染已除去。如未除去,重新清洁,使用最新的背景校正定定量量PCR实实验验要素要素1.目标基因 样品2.标准曲线 标准品3.监控污染 阴性对照4.监控系统故障 阳性对照5.校准物理误差 参比荧光1 目标基目标基因因 样品样品 细胞死亡时RNA迅速被RNases酶降解 另外,样本(组织,血液等)一旦离开机体后,基因表达谱 会发生改变可能的解决方案:将样本迅速完全融解在有机溶剂中液氮冻存将组织/细胞存放在稳定的溶液中加入无毒的组织防腐剂和RNA稳定剂选择样本的提取方法有机溶剂法提取的样本纯度高劳
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