课题2--多聚酶链式反应扩增DNA片段课件.ppt

1、多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR技术技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术体外扩增技术。1 1、DNADNA分子的组成成分和结构分子的组成成分和结构DNA DNA 分子的基本组成单位是分子的基本组成单位是 .共有共有 种种,每个基本单位是由一分子每个基本单位是由一分子的的 、一分子的、一分子的 、和一分子的和一分子的 构成。构成。脱氧核甘酸脱氧核甘酸4 4磷酸磷酸碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖 那么那么DNADNA分子的平面结构怎分子的平面结构怎样呢？样呢？二二 、基础知识、基础知识脱氧脱氧核糖核糖含氮

2、碱基含氮碱基磷酸磷酸A G C T1 1、DNADNA的基本单位的基本单位12345OATGCAGCT5端端3端端5端端3端端 识别识别：DNA分子的分子的3 端与端与5 端端-OH端为端为3 ;磷酸基团的末磷酸基团的末端为端为5。2 2、DNADNA分子复制的过程分子复制的过程参与的组分参与的组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶打开打开DNADNA双链双链DNADNA母链母链提供提供DNADNA复制的模板复制的模板4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸合成子链的原料合成子链的原料DNADNA聚合酶聚合酶催化合成催化合成DNADNA子链子链引物引物使使DNADNA聚合酶能够从引物的

3、聚合酶能够从引物的3 3 端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物（RNA）打开打开DNADNA双链双链模板模板合成子链原料合成子链原料催化子链合成催化子链合成使使DNADNA聚合酶能从引聚合酶能从引物物3 3端开始连接脱氧端开始连接脱氧核苷酸核苷酸 思考：思考：是什么？是什么？体外扩增体外扩增DNA DNA 如何提供相似环境？如何提供相似环境？变性变性（80-100）TaqTaq聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）20203030个核苷酸构个核苷酸构成成DNADNA或或RNARNADNA双链双链单链单链

4、变性（加热变性（加热80-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）4 4、DNA DNA 分子的热变性原理：分子的热变性原理：变性的目的：变性的目的：复性的目的：复性的目的：解开双链解开双链有利于引物有利于引物和引物和引物与两条单与两条单链的结合链的结合一、一、PCRPCR的原理的原理（PCRPCR的技术原理）的技术原理）1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮3、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端端延伸延伸2 2、步骤：、步骤：变性变性 复性复性延伸延伸PCRPCR技术的原理总结技术的原

5、理总结 利用利用DNA分子的分子的热变性原理热变性原理，通过控制，通过控制温度温度来控制双链的来控制双链的解旋与结合解旋与结合，从而完成体外，从而完成体外DAN分分子的子的扩增扩增。体外体外DNADNA复制的条件：复制的条件：四种脱氧核苷四种脱氧核苷酸、耐高温的酸、耐高温的DNADNA聚合酶、引物、聚合酶、引物、模板；模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：复制的方向：子链的子链的5端向端向 3端延伸。端延伸。二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/

6、3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物可以作为模板参与反应，并且由引物延伸延伸而成的而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的的延伸，这样，延伸，这样，DNADNA聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处处于两个引物之间的于两个引物之间的DNADNA序列序列，使这段固定长度使这段固定长度的序

7、列的序列呈指数扩增。呈指数扩增。PCRPCR的反应过程总结的反应过程总结三、三、PCR反应的实验操作反应的实验操作三、三、PCR反应的实验操作反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在）将微量离心管放在离心机离心机上（上（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序

8、（仪的循环程序（反应反应）四、结果分析与评价四、结果分析与评价DNA 含量的测定：含量的测定：稀释稀释对照调零对照调零测定测定计算（公式见计算（公式见P63）波长波长260nm处读数处读数蒸馏水蒸馏水做对照做对照50倍倍 测定测定并并 的含量为的含量为体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细在解旋酶作用下，细胞提供胞提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合

9、酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。边复制，多起点复制。半保留复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的55端向端向 33端端延伸延伸子链的子链的55端向端向 33端延伸端延伸课堂小结课堂小结多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度

10、影响PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管放入放入PCR设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算练习巩固练习巩固1、关于、关于PCR技术的应用，错误的一项是技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNA序列测定序列测定B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列序列测定测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A 原理简单原理简单 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作从子链的从子链的5端向端向3端延伸端延伸4、做、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A 反复洗涤反复洗涤 B 不怕外源不怕外源DNA污染污染C 高压灭菌高压灭菌 D 在在20 储存储存