试验三琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNA课件.ppt
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1、1实实验验内内容容 实验一实验一 实验准备及培养基的制备与灭菌实验准备及培养基的制备与灭菌实验二实验二 质粒质粒DNADNA的提取的提取实验三实验三 琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNADNA实验四实验四 DNADNA限制性内切酶酶切及电泳分析限制性内切酶酶切及电泳分析实验五实验五 DNADNA片段的片段的PCRPCR扩增扩增实验六实验六 PCRPCR产物电泳检测及切胶回收产物电泳检测及切胶回收实验七实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验八实验八 植物基因组植物基因组DNADNA提取提取121.实验准备:器皿清洗、培养基配制、分装灭菌、取
2、用保存2.离心机的使用打开离心机电源开关,进入待机状态。选择合适的转头离心管平衡误差应在0.1克以内。选择离心参数:主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅的使用及实验操作注意事项的使用及实验操作注意事项实验一实验一 实验准备及培养基制备与灭菌实验准备及培养基制备与灭菌【实验目的实验目的】3将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。按下离心机盖门,如盖门未盖牢,离心机将不能启动。按START键,开始离心。离心开始后(特别是高速离心时)应等离心速度达到所设的速度时才能离开,一旦发现离心机有异常(如不平衡而导致机器明显震动,或噪音很大),应立即按ST
3、OP键,必要时直接按电源开关切断电源,停止继续离心,并找出原因。机器如发现故障,请及时与有关人员联系。使用结束后请清洁转头和离心机腔,不要关闭离心机盖,利于湿气蒸发。4离心管在转子中的摆放位置离心管在转子中的摆放位置53 3.微量移液器的使用微量移液器的使用o 移液器是生化与分子生物学实验室常用的小件精密设备,移液器能否正确是用,直接关系到实验的准确性与重复性,同时关系到移液器的使用寿命。o 移液器由可调的机械装置和可替换的吸头组成,不同型号的移液器吸头有所不同,实验室常用的移液器根据最大吸用量有2.5ul,10ul,20ul,200ul,1ml,5ml等规格。o 微量移液器的操作步骤:将微量
4、移液器装上吸头(俗称枪头)(不同规格的移液器配用不同的吸头)将微量移液器按钮轻轻压至第一停点;6垂直握持微量移液器,使吸嘴浸入液样面下几毫米,千万不要将吸嘴直接插到液体底部;缓慢、平稳地松开控制按钮,吸上样液。否则液体进入吸嘴太快,导致液体倒吸入移液器内部,或吸入体积减少;等一秒钟后将吸嘴提离液面排出液体时,平稳地把按钮压到第一停点,再把按钮压至第二停点以排出剩余液体;提起微量移液器,将吸嘴在容器壁擦过;然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。7移液器的使用移液器的使用2022-8-68量液操作注意事项a.连续可调移液器的取用体积调节要轻缓,严禁超过最连续可调移液器的取用体积调节要轻缓,严禁超过最大或最小量
5、程;大或最小量程;b.b.在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置,在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置,平时不用时置移液器于架上;平时不用时置移液器于架上;c.c.吸取液体时,动作应轻缓,防止液体随气流进入移液吸取液体时,动作应轻缓,防止液体随气流进入移液器的上部;器的上部;d.d.在吸取不同的液体时,要切记更换吸头;在吸取不同的液体时,要切记更换吸头;e.e.移液器要进行定期校准,一般由专业人员来进行。移液器要进行定期校准,一般由专业人员来进行。2022-8-694.高压蒸气灭菌锅的使用及注意事项首先将内层锅取出,再向外层锅内加入适量的水,使水首先将内层锅取出,再向外层锅内加入
6、适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。面与三角搁架相平为宜。切物忘记加水,同时加水量不切物忘记加水,同时加水量不可过少,以防灭菌锅烧干而损坏加热棒或引起炸裂事故。可过少,以防灭菌锅烧干而损坏加热棒或引起炸裂事故。放入内层锅,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,放入内层锅,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。塞。加盖,并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再加盖,并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。
7、再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺旋以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺旋松紧一致,避免漏气。松紧一致,避免漏气。用电加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内用电加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的空气。待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的空气。待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。本实所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。本实验用验用0.11MPa,121.5,20min0.11MPa,121.5,20min灭菌。灭菌。2
8、022-8-611o 灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽,才能关上排气阀,维持所需压力。全排尽,才能关上排气阀,维持所需压力。灭菌所需时间到后,切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,灭菌所需时间到后,切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至当压力表的压力降至“0 0”时,打开排气阀,旋松螺栓。打时,打开排气阀,旋松螺栓。打开盖子,取出灭菌物品。开盖子,取出灭菌物品。!压力一定要降到压力一定要降到“0 0”时,才能打开排气阀,开盖取物。否时,才能打开排气阀,开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由
9、于内外压则就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口,造成棉塞沾染培养基而发生污染,甚力不平衡而冲出瓶口,造成棉塞沾染培养基而发生污染,甚至灼伤使用者至灼伤使用者。2022-8-612灭菌打湿的包装可置于灭菌打湿的包装可置于7070温箱中烘干备用。也可将取温箱中烘干备用。也可将取出的灭菌培养基放入出的灭菌培养基放入3737温箱培养温箱培养2424小时,经检查若无杂小时,经检查若无杂菌生长,即可待用。菌生长,即可待用。5.5.分组:分组:4-54-5人一大组,一个实验桌人一大组,一个实验桌1 1套移液枪套移液枪6.6.实验器材准备:实验器材准备:每组蓝枪头和黄枪头各每组
10、蓝枪头和黄枪头各1 1盒,全班另加盒,全班另加2 2包,包,1.5ml1.5ml的离的离心管心管1 1盒或盒或1 1包,包,30ml30ml离心管离心管1212个,培养皿个,培养皿1010个。全班配制个。全班配制LBLB固体和液体培养基各固体和液体培养基各1000ml1000ml,分装成,分装成200ml200ml每份。每份。2022-8-613【思考题思考题】1.高压蒸气灭菌之前,为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后,为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀,开盖取物?2.移液操作应注意哪些事项?2022-8-614【LBLB培养基的制备及灭菌培养基的制备及灭菌】【实验目的实验目的】通过对L
11、B培养基的配制,掌握配制培养基的一般方法和步骤。2022-8-615o LBLB培养基培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基,是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基,它含有酵母提取物、蛋白胨和它含有酵母提取物、蛋白胨和NaClNaCl。其中酵母提取物为。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源,磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源,微生物提供碳源和能源,磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源,而而NaClNaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。量琼脂作凝固剂。o 琼脂在常用浓度下琼脂在常用浓度下9696时溶化,一般实际应用时在沸水时溶化,一般
12、实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化,以免琼脂烧焦。琼脂浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化,以免琼脂烧焦。琼脂在在4040时凝固,通常不被微生物分解利用。固体培养基时凝固,通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。【实验原理实验原理】2022-8-616LBLB培养基配方培养基配方o 由于这种培养基多用于培养细菌,因此,要用由于这种培养基多用于培养细菌,因此,要用稀酸或稀碱将其稀酸或稀碱将其pHpH调至中性或微碱性。调至中性或微碱性。LB固体培养基的配方如下:固体培养基的配方如下:胰蛋白胨胰蛋白胨 1
13、0g/L 酵母提取物酵母提取物 5g/L NaCl 10g/L 琼脂琼脂 15g/L 蒸馏水定容至蒸馏水定容至 1000mL,调,调pH 7.4。2022-8-617【试剂试剂】酵母提取物,蛋白胨,酵母提取物,蛋白胨,NaCl,琼脂;,琼脂;1mol/L NaOH,1mol/L HCl;试管,三角烧瓶,烧杯,量筒,玻棒,培养基分试管,三角烧瓶,烧杯,量筒,玻棒,培养基分装器,天平,牛角匙,高压蒸汽灭菌锅,装器,天平,牛角匙,高压蒸汽灭菌锅,pH试纸试纸(pH 5.59.0),棉花,牛皮纸,记号笔,麻绳,),棉花,牛皮纸,记号笔,麻绳,纱布等。纱布等。2022-8-618【培养基配制培养基配制】
14、配制:每升配制:每升液体培养基液体培养基,应在,应在950ml蒸馏水中加入蒸馏水中加入 胰蛋白胨胰蛋白胨 10g,酵母提取物酵母提取物 5g,NaCl 10g。摇动容器直至完全溶解,加入摇动容器直至完全溶解,加入 5mol/L NaOH调节调节pH至至7.4,定,定容容1L。LB固体培养基固体培养基:在液体培养基基础上调:在液体培养基基础上调PH值、定容、分装后,值、定容、分装后,每升培养基加入每升培养基加入15克琼脂。克琼脂。灭菌:灭菌:0.11MPa,121.5,20min灭菌。灭菌。2022-8-619【操作步骤操作步骤】1 1称量称量 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、
15、按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaClNaCl放放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速。另外,称药品时入烧杯中。蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速。另外,称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净、严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净、擦干,再称取另一药品,瓶盖也不要盖错。擦干,再称取另一药品,瓶盖也不要盖错。2 2溶化溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品全溶解后,补充水分到所需的总体在石棉网上加热使其溶解
16、。待药品全溶解后,补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基,将称好的琼脂放入已溶化的药品中,再加积。如果配制固体培养基,将称好的琼脂放入已溶化的药品中,再加热溶化,在琼脂溶化的过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底使烧杯破热溶化,在琼脂溶化的过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。裂。最后补足所失的水分。2022-8-620【操作步骤操作步骤】3 3调调pHpH 在未调在未调pHpH前,先用精密前,先用精密pHpH试纸测量培养基的原始试纸测量培养基的原始pHpH值,如果值,如果pHpH偏偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH1mol
17、/L NaOH,边加边搅拌,并随时用,边加边搅拌,并随时用pHpH试纸测其试纸测其pHpH值,直至值,直至pHpH达达7.47.4。反之,则用。反之,则用1mol/L HCl1mol/L HCl进行调节。进行调节。注注意意pHpH值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的浓度。浓度。对于有些要求对于有些要求pHpH值较精确的微生物,其值较精确的微生物,其pHpH的调节可用酸度计进行的调节可用酸度计进行(使用方法,可参考有关说明书)。(使用方法,可参考有关说明书)。2022-8-621【操作步骤操作步骤】4 4分装分装o 按实
18、验要求,可将配制的培养基分装入三角烧瓶内。分装按实验要求,可将配制的培养基分装入三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。塞而引起污染。o 分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。o LBLB液体培养基分装:液体培养基分装:4 4瓶瓶5ml5ml,4 4瓶瓶50ml50ml,3 3瓶瓶250ml250ml。o LBLB固体培养基分装:固体培养基分装:100ml/100ml/瓶。瓶。2022-8-622【操作步骤操作步骤】5加塞加塞培养基分装完毕后,在试
19、管口或三角烧瓶口上塞上棉塞,以阻止外培养基分装完毕后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好的通气性能。界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好的通气性能。6包扎包扎加塞后,将全部试管用麻绳捆扎好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以加塞后,将全部试管用麻绳捆扎好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同
20、样用记号笔注明培养基名绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。称、组别、日期。2022-8-623【操作步骤操作步骤】7灭菌灭菌 将上述培养基以将上述培养基以0.11MPa,121,20分钟高压蒸汽灭菌。分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存。如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存。8灭菌结束灭菌结束后,待压力将至后,待压力将至“0”时,取出灭菌物品置于烘箱时,取出灭菌物品置于烘箱中或干净处备用。中或干净处备用。9无菌检查无菌检查 将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入37的温室中培养的温室中培养2448小时,以检查小时,以检查灭菌
21、是否彻底。灭菌是否彻底。2022-8-624【思考题思考题】1.培养基配制好后,为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?2022-8-625实验二实验二 质粒质粒DNADNA的提取的提取【实验目的与意义实验目的与意义】质粒质粒DNADNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术,但提取方法有很多种,以下介绍一种最常用的方法。术,但提取方法有很多种,以下介绍一种最常用的方法。碱裂解法:此方法适用于小量质粒碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNADNA的提取,提取的质粒的提取,提取的质粒DN
22、ADNA可直接用于酶切、可直接用于酶切、PCRPCR扩增、银染序列。扩增、银染序列。通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNADNA。2022-8-626【实验原理实验原理】碱变性抽提质粒碱变性抽提质粒DNADNA是基于染色体是基于染色体DNADNA与质与质粒粒DNADNA的变性与复性的差异而达到分离的目的变性与复性的差异而达到分离的目的。的。2022-8-627细菌裂解的方法细菌裂解的方法o碱裂解法:碱裂解法:0.2molNaOH+1%SDS0.2molNaOH+1%SDSo煮沸裂解法煮沸裂解法:沸水煮沸沸水煮沸4040秒秒oSDSSDS裂解法:裂解法:1
23、0%SDS,10%SDS,一般用于一般用于 质粒大量提取质粒大量提取。2022-8-628DNADNA抽提原理抽提原理oDNADNA是具有一定结构的物质,一些特是具有一定结构的物质,一些特殊的环境会导致殊的环境会导致DNADNA的变性,如加热、的变性,如加热、极端极端pHpH值、有机溶剂、尿素、酰胺试值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等,而适宜的环境又可以使剂等,而适宜的环境又可以使DNADNA复复性。性。2022-8-629DNADNA抽提原理抽提原理o SDSSDS是一种阴离子表面活性剂,既可使细菌细胞裂解,又可是一种阴离子表面活性剂,既可使细菌细胞裂解,又可使一些蛋白质变性,因此用使一些蛋白质
24、变性,因此用SDSSDS处理细菌,会导致细菌细胞壁的破裂,处理细菌,会导致细菌细胞壁的破裂,从而使质粒从而使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从细胞中同时释放出来。从细胞中同时释放出来。释放出来的释放出来的DNADNA在强碱性(在强碱性(NaOHNaOH)条件下发生变性。再用酸性乙)条件下发生变性。再用酸性乙酸钾来中和,使溶液处于中性,质粒酸钾来中和,使溶液处于中性,质粒DNADNA将迅速复性,而基因组将迅速复性,而基因组DNADNA因分子较大,难以复性。因分子较大,难以复性。离心后,质粒离心后,质粒DNADNA将在上清中,而基因组将在上清中,而基因组DNADNA则与细胞碎片一起
25、沉则与细胞碎片一起沉淀至离心管底部。通过这种方法即可将质粒淀至离心管底部。通过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提取出来。从细菌中提取出来。2022-8-630【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】(一)仪器(一)仪器1.1.恒温培养箱恒温培养箱2.2.台式离心机台式离心机3.3.恒温摇床恒温摇床4.4.高压灭菌锅高压灭菌锅(二)材料(二)材料1.1.葡萄糖葡萄糖2.2.三羟甲基氨基甲烷(三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris)3.3.乙二胺四乙酸(乙二胺四乙酸(EDTA)EDTA)4.4.氢氧化钠氢氧化钠5.5.十二烷基硫酸钠(十二烷基硫酸钠(SDS)SDS)6.6.乙酸钾乙酸钾 7.7.冰
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