(完整版)3-环境污染的微生物检测课件.ppt

1、Environmental Microbiology郑州大学生物工程系 席 宇环境微生物学环境微生物学第十章第十章 环境污染的微生物检测环境污染的微生物检测主主 要要 内内 容容 环境污染的指示微生物环境污染的指示微生物 污染物生物毒性的微生物学检测方法污染物生物毒性的微生物学检测方法污染物致突变的微生物学检测方法污染物致突变的微生物学检测方法微生物的存在离不开环境，而微生物的数量分微生物的存在离不开环境，而微生物的数量分布和种群组成、理化性状、遗传变异等，又是布和种群组成、理化性状、遗传变异等，又是环境状况的综合而客观的反映。环境状况的综合而客观的反映。因此利用微生物我们可以指示环境状况，监

2、测因此利用微生物我们可以指示环境状况，监测环境污染环境污染,评价污染物毒性。评价污染物毒性。第一节第一节 环境污染的指示微生物环境污染的指示微生物指示微生物指示微生物（indicator microorganism）:也称也称为指示菌为指示菌（indicator bacteria）是指在常规的是指在常规的环境监测中，用于指示环境样品污染程度，并环境监测中，用于指示环境样品污染程度，并评价环境污染状况的具有代表性的微生物。评价环境污染状况的具有代表性的微生物。一、一般污染指示微生物一、一般污染指示微生物1.细菌总数细菌总数（total bacteria count）:指环境中被测指环境中被测样品

3、，在一定条件下培养后所得的样品，在一定条件下培养后所得的1ml或者或者1g检检样中所含的细菌样中所含的细菌菌落菌落总数。总数。细菌总数主要反映环境中细菌总数主要反映环境中异养型细菌异养型细菌的的污染的的污染度，也间接反映一般营养性有机物的污染程度度，也间接反映一般营养性有机物的污染程度微生物微生物总数的表示方法：总数的表示方法：细菌总数一般采用：细菌总数一般采用：个个/ml、cfu/ml 或或cfu/g来表来表示。示。cfu(colony forming unit)是指单位体积、单是指单位体积、单位表面积或单位质量检样中菌落形成单位。位表面积或单位质量检样中菌落形成单位。pfu(plaque

4、formation unit):空斑形成单位，用空斑形成单位，用于病毒、蛭弧菌的效价测定。于病毒、蛭弧菌的效价测定。2.霉菌和酵母菌总数霉菌和酵母菌总数(fungi and yeast count)指环境中被测样品经过处理，在一定条件下培养指环境中被测样品经过处理，在一定条件下培养后所得的后所得的1ml或者或者1g检样中所含的霉菌和酵母菌检样中所含的霉菌和酵母菌菌落总数。菌落总数。检测霉菌和酵母菌，是从检测霉菌和酵母菌，是从另一生物学另一生物学层次，反层次，反映环境的一般污染。映环境的一般污染。我国在我国在食品食品、药品药品和和化妆品化妆品都规定了检出标准都规定了检出标准(p387)二、粪便污

5、染指示菌二、粪便污染指示菌1.总大肠菌群总大肠菌群（total coliform）也称为也称为大肠菌群大肠菌群(coliform 或者或者 coliform group)。大肠菌群是一群需氧和兼性厌氧的，能在大肠菌群是一群需氧和兼性厌氧的，能在3737培培养养2424h h内使乳糖发酵产酸产气的革兰氏阴性无芽内使乳糖发酵产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌，包括胞杆菌，包括埃希氏菌属埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属柠檬酸杆菌属、肠杆肠杆菌属菌属、克雷伯氏菌属克雷伯氏菌属等。等。2.粪大肠菌群粪大肠菌群（fecal coliform）指能够在指能够在44.5(44-45)(44-45)发酵乳糖的发酵乳糖的大肠

6、菌群大肠菌群，亦称耐热性大肠菌群亦称耐热性大肠菌群(thermotolerant coliform)。粪大肠杆菌也包括同样的粪大肠杆菌也包括同样的4个属，但以埃希氏菌个属，但以埃希氏菌属为主。属为主。粪大肠菌群与粪便中大肠杆菌数目直接相关，在粪大肠菌群与粪便中大肠杆菌数目直接相关，在外界环境中不易繁殖，作为粪便污染指示菌意义外界环境中不易繁殖，作为粪便污染指示菌意义更大更大Coliforms are several different types of bacteria that exist in the intestines of warm blooded animals and are f

7、ound in bodily waste,animal droppings,and naturally in soil.Coliform bacteria are described and grouped,based on their common origin or characteristics,as either total or fecal coliforms.The group of total coliforms includes faecal coliform bacteria,such as Escherichia coli(E.coli),as well as other

8、types of coliform bacteria that can survive in soil and vegetation.Total coliforms do not necessarily indicate recent water contamination by faecal waste,however the presence or absence of these bacteria in treated water is often used to determine whether water disinfection is working properly.我国目前水

9、质标准中规定的大肠菌群数（我国目前水质标准中规定的大肠菌群数（cfu/L）：）：饮用水饮用水33 游泳池水 100地表水地表水 第一级第一级500500 第二级第二级1000010000 第三级第三级5000050000*第二节第二节 污染物生物毒性的微生物学检测方法污染物生物毒性的微生物学检测方法一、生态毒理学的基本概念一、生态毒理学的基本概念1.毒性的概念与检测毒性的概念与检测毒性毒性（toxicity）:指外源化合物与肌体接触或进指外源化合物与肌体接触或进入体内的易感部位后，能引起损害作用的相对入体内的易感部位后，能引起损害作用的相对能力，毒性越强的物质造成损害所需的剂量和能力，毒性越强

10、的物质造成损害所需的剂量和浓度越低。浓度越低。毒性的检测一般有毒性的检测一般有动物试验动物试验和和微生物试验微生物试验当我们以微生物为检测手段时多称为当我们以微生物为检测手段时多称为生物毒生物毒性性（biotoxicity）微生物检测方法的原理微生物检测方法的原理是选择微生物的某一项或是选择微生物的某一项或几项生理指标作为指征，根据待测物质影响或者几项生理指标作为指征，根据待测物质影响或者抑制这些指征的程度来判断毒性的强度。抑制这些指征的程度来判断毒性的强度。2.毒性试验的常用参数毒性试验的常用参数致死剂量或致死浓度致死剂量或致死浓度：Lethal Dose，LD或者或者 Lethal Con

11、centration，LC.绝对致死剂量：绝对致死剂量：Absolute Lethal Dose,LD100半数致死剂量：半数致死剂量：Median Lethal Dose,LD50最小致死剂量：最小致死剂量：Minimum Lethal Dose,MLD最大耐受剂量：最大耐受剂量：Maximum Lethal Dose,LD0半数效应浓度半数效应浓度（Median Effect Concentration,EC50）能够影响微生物某种正常生理指标值能够影响微生物某种正常生理指标值50%所需所需的待测物质浓度的待测物质浓度,有时候也指能够引起有时候也指能够引起50%的受的受试生物的某种效应变化

12、的浓度试生物的某种效应变化的浓度.半数抑制浓度半数抑制浓度（Median Inhibition Concentration,IC50）能够引起受试生物的的某种效应能够引起受试生物的的某种效应50%抑制的浓度。抑制的浓度。二、原核微生物检测方法二、原核微生物检测方法生物发光是某些生物的一种生理现象，海洋生物生物发光是某些生物的一种生理现象，海洋生物中更为多见。中更为多见。（一）发光细菌（一）发光细菌-生物发光抑制试验生物发光抑制试验上世纪上世纪70年代至年代至80年代初，国外科学家首次从海年代初，国外科学家首次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感

13、的发光细菌，用于检测水体生物毒性，现已成为一发光细菌，用于检测水体生物毒性，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段。种简单、快速的生物毒性检测手段。美国美国Microbics公司设计制造了一套微毒测定仪器。公司设计制造了一套微毒测定仪器。中国科学院南京土壤研究所成功地研制中国科学院南京土壤研究所成功地研制DXY-2型型的生物发光光度计。的生物发光光度计。华东师范大学生物系也分别成功地研制了华东师范大学生物系也分别成功地研制了9N-1型型的生物毒性测试仪。的生物毒性测试仪。美国的美国的Beckman公司研制出系列的细菌发光检测公司研制出系列的细菌发光检测仪，将毒性的测定过程标准化，命名为仪，将

14、毒性的测定过程标准化，命名为Microtox1.发光细菌发光细菌(luminous bacteria)主要从海洋中分离的一类能够产生生物发光的细主要从海洋中分离的一类能够产生生物发光的细菌，目前发现的主要有菌，目前发现的主要有弧菌属弧菌属、发光杆菌属发光杆菌属，异异短杆菌属短杆菌属。发光细菌均为发光细菌均为革蓝氏阴性革蓝氏阴性、兼性厌氧菌兼性厌氧菌2.试验原理试验原理发光菌检测法是以一种非致病的明亮发光杆菌作发光菌检测法是以一种非致病的明亮发光杆菌作指示生物，以其发光强度的变化为指标，测定环指示生物，以其发光强度的变化为指标，测定环境中有害有毒物质的生物毒性的一种方法。境中有害有毒物质的生物毒

15、性的一种方法。细菌发光的生物学机制为：细菌发光的生物学机制为：生物发光是发光细菌生理状态的一个反映，在生长生物发光是发光细菌生理状态的一个反映，在生长的对数期发光能力最强。的对数期发光能力最强。当环境条件不良或者有毒物质存在时，因为细菌的当环境条件不良或者有毒物质存在时，因为细菌的荧光素酶活性荧光素酶活性或或细胞呼吸细胞呼吸受到抑制，发光的能力受受到抑制，发光的能力受到影响而减弱，其减弱程度与毒性的大小和浓度成到影响而减弱，其减弱程度与毒性的大小和浓度成一定的比例关系。一定的比例关系。3.测试方法测试方法菌种复苏菌种复苏样品处理样品处理毒性测定毒性测定向测试管中定量加入菌液和样品，以苯酚作为阳

16、性有机毒物对照，Zn2+作为阳性无机毒物对照，蒸馏水为阴性对照。15 下培养下培养5min或者或者15min，就可以生物发光光就可以生物发光光度计直接读出或者扫描出度计直接读出或者扫描出5min或者或者15min的光量的光量抑制百分率抑制百分率(Inhibition rate,IR)IR=阴性对照组指标值-实验组指标值阴性对照组指标值100%IR为为50%时样品的剂量即为时样品的剂量即为IC50Microtox Toxicity TestingMicrotox is a standardized toxicity test system which is rapid,sensitive,rep

17、roducible,ecologically relevant and cost effective.It is recognised and used throughout the world as a standard test for aquatic toxicity testing.The Procedure employs the bioluminescent marine bacterium(Vibrio fischeri)as the test organism.The bacteria are exposed to a range of concentrations of th

18、e material being tested.The reduction in intensity of light emitted from the bacteria is measured along with standard solutions and control samples.The change in light output and concentration of the toxicant produce a dose/response relationship.The results are normalised and the EC50(concentration

19、producing a 50%reduction in light)is calculatedThe Microtox system has been used as an aquatic toxicity test since the early 1980s and is accepted as a standard test in a number of countries including Australia.In the United States it is a recognised test method in a number of federal programs.The A

20、cceptance of MicrotoxThe U.S.EPA,has adopted Microtox as a standard test in an ongoing program of Assessment and Remediation of Contaminated Sediments.Microtox has been adopted by the U.S Fish and Wildlife Service as a screening test at the National Fisheries Contaminant Research Centre.Microtox is

21、similarly recognised in Canada,the United Kingdom,Germany,Sweden and the Netherlands.In Australia,the Microtox system is recognised by and listed in discharge,trade waste and effluent regulations by a number of Authorities.In Victoria,Microtox toxicity is used to check regulatory compliance of some

22、discharges and effluents.The Benefits of MicrotoxThe Microtox system has many benefits over other toxicity testing systems.The low cost enables it to be used as a regular monitoring and screening test.A full Microtox assay is about a tenth of the cost of other toxicity tests.It is usually desirable

23、to have toxicity results as soon as possible.Microtox assays can be completed within an hour and a report available within 24 hours,making them a very rapid form of testing.二、硝化作用抑制试验二、硝化作用抑制试验（nitrification inhibition test）1989年国际标准化组织把该方法作为检测化合物年国际标准化组织把该方法作为检测化合物或废水毒性的标准化方法（或废水毒性的标准化方法（ISO9509）之一

24、之一1.试验原理试验原理NH3 NO2-NO3-亚硝化细菌亚硝化细菌硝化细菌硝化细菌二、测试方法二、测试方法硝化作用抑制试验可单独选择亚硝化单胞菌或硝硝化作用抑制试验可单独选择亚硝化单胞菌或硝化杆菌，也可采用活性污泥中的混合菌株。化杆菌，也可采用活性污泥中的混合菌株。菌种活化与增殖菌种活化与增殖样品稀释与设置样品稀释与设置培养与取样培养与取样比较与计算比较与计算三、真核微生物检测方法三、真核微生物检测方法（一）藻类生长抑制试验（一）藻类生长抑制试验（alage growth inhibition test）1.试验原理试验原理藻类对水体污染的反应十分敏感。藻类对水体污染的反应十分敏感。藻类的藻

25、类的生长量生长量和水体污染的关系很大。和水体污染的关系很大。水质监测和毒性检测常用的有水质监测和毒性检测常用的有硅藻硅藻、栅藻栅藻、小小球藻球藻等等2.试验方法试验方法藻类藻类生长量的测量生长量的测量藻体生长量藻体生长量 放氧量放氧量摄取摄取14C量量细胞细胞DNA和和ATP的测定的测定藻体藻体生长量的测量生长量的测量细胞计数细胞计数藻体干重藻体干重藻液浑浊度藻液浑浊度叶绿素叶绿素a含量含量繁殖纯藻种繁殖纯藻种试验配置与藻类接种试验配置与藻类接种同等适宜条件下培养同等适宜条件下培养定时取样检测并绘制生长曲线定时取样检测并绘制生长曲线计算与分析计算与分析3.毒性测定程序毒性测定程序第三节第三节

26、污染物致突变的微生物学检测方法污染物致突变的微生物学检测方法污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。染物的遗传毒性效应。目前一般认为人类癌症的发生与环境污染物的致目前一般认为人类癌症的发生与环境污染物的致突变性有一定的关系。突变性有一定的关系。诱变剂作用的共性原则：诱变剂作用的共性原则：超过超过95%95%的致癌物质对微生物有诱变作用；的致癌物质对微生物有诱变作用；化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成

27、正比。性成正比。所有这些检测试验都基于两个原则所有这些检测试验都基于两个原则90%90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。人和细菌在人和细菌在DNA的结构及特性的结构及特性方面是一致的，方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于于人的人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。或其他不良的后果。生命的“生物化学统一性生物化学统一性”法则：美国加利福尼亚大学美国加利福尼亚大学Bruce Ames教授教授等于等于1975年年正式建立的沙门氏菌回复突变试验（亦称正式建立的

28、沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试试验）已被世界各国广为采用，是检测环境诱变剂验）已被世界各国广为采用，是检测环境诱变剂的的首选试验。的的首选试验。一、一、AmesAmes试验试验Ames试验是检测试验是检测DNADNA碱基序列碱基序列是否发生改变即是否发生改变即基因突变的一种方法。基因突变的一种方法。1.1.试验原理试验原理鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的的组氨酸营养缺陷型（组氨酸营养缺陷型（his-）菌株，在含微量组菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在

29、显微镜下才胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。可见的菌落。野生型与野生型与组氨酸营养缺陷型关系如下：组氨酸营养缺陷型关系如下：野生型野生型his+营养缺陷型营养缺陷型his-正向突变正向突变回复突变回复突变回复突变回复突变(reverse mutation或或back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。到恢复，这

30、种第二次突变称为回复突变。实验菌株实验菌株目前推荐使用的一套菌株是目前推荐使用的一套菌株是组氨酸营养缺陷型菌组氨酸营养缺陷型菌株株TA97、TA98、TA100和和TA102。鉴定前先进行鉴定前先进行增菌培养。增菌培养。为鉴定结果可靠，需同时培养为鉴定结果可靠，需同时培养野生型野生型TV菌株菌株，作，作为测试菌基因型之对照。为测试菌基因型之对照。由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使待测物活化，使AmesAmes试验的准确率达试验的准确率达80-90%80-9

31、0%。哺乳动物微粒体酶哺乳动物微粒体酶S9混合液混合液：雄性大鼠肝脏匀浆物上清液：雄性大鼠肝脏匀浆物上清液+辅酶辅酶 +G-6-PMost environmental genotoxins are found in an inactive state(progenotoxin)and must be metabolically activated to become DNA-damaging substances.The incorporation of a mammalian(rodent)hepatic metabolic activation system-the postmitocho

32、ndrial supernatant fraction(commonly referred to as the S9 fraction)-into a genotoxicity test significantly improved the assays sensitivity to a broader spectrum of genotoxins.The use of fish S9(Johnson,1993c)has increased the ecological relevancy of these tests in aquatic ecosystems.This addition o

33、f a hepatic metabolic activation system has become an important milestone in the development of environmental genotoxicity testing.检测鼠伤寒沙门氏菌检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率的回复突变率2.2.具体操作程序具体操作程序实验方法很多，目前主要应用的是斑点法和平板掺实验方法很多，目前主要应用的是斑点法和平板掺入法，此外还有一些其它的方法。入法，此外还有一些其它的方法。

34、Ames试验Ames试验AmesAmes试验的应用范围试验的应用范围检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；检测水源水和饮用水的致突变性，探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据 检测土壤、污泥、废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，防止土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害 用Ames试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐

35、患 用用AmesAmes试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等Ames试验的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行。但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用，但如果能在这种药物上市之前就进行但如果能在这种药物上市之前就进行AmesAmes试验检测，那么这种大试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。二、发光细菌实验（二、发光细菌实

36、验（MutatoxMutatox）发光细菌可用于各类污染物的急性毒性检测，经发光细菌可用于各类污染物的急性毒性检测，经特殊处理后还可用于污染物的特殊处理后还可用于污染物的遗传毒性遗传毒性的检测的检测检测的主要原理为发光细菌的检测的主要原理为发光细菌的自发暗变异株自发暗变异株与与致致突变物突变物接触后，可恢复一定强度的发光能力。接触后，可恢复一定强度的发光能力。美国的美国的Microbics公司将这一方法标准化，命名为公司将这一方法标准化，命名为Mutatox.Mutatox toxicity testThe Mutatox test is considered as a promising t

37、ool for detection of mutagenic compounds in environmental samples.The genotoxicity of water samples can be determined with Mutatox Genotoxicity Test System(Microbics Corporation,CAL U.S.A.).The Mutatox assay detects genotoxins with a dark mutant strain of the luminescent bacterium Photobacterium pho

38、sphoreum.DNA-damaging substances are recognized by measuring the ability of a test sample to restore the luminescent state in the bacterial cells.Light produced by luminescent bacteria makes an easy quantitative endpoint in the genotoxicity assayThe amount of light increase indicates the genotoxicit

39、y of the sample.Various genotoxins,base-substitution or frame-shift,DNA synthesis inhibitors,and DNA-intercalating agents,have been detected with the Mutatox assay.Mutatox protocol is very simple,requiring minimal expertise.The assay may be initiated and completed in less than 24 hours.Prepackaged d

40、ehydrated media,freeze-dried bacteria,and standard disposable reaction tubes require only a few hydration,mixing,and dilution steps and eliminate the rigors,tedium and cost of sterile technique.Bacteria are nonpathogenic,clonal,and require no reisolation or reculturing;in addition,they are completel

41、y disposable without causing any environmental harmIncubation time is short which reduces the possibility of cross-contamination with bacterial contaminants.Quality assurance and quality control are simply maintained because the protocol develops a clear paper trail and the archival tester strains a

42、nd test media are easily stored for inspection or auditThe volume of the reactants is low;as a result,the quantity of toxic wastes and the cost of their disposal is significantly reduced.The assay is also conducted with exogenous metabolic activation,traditionally a rat hepatic microsomal mixture.Th

43、e test is carried out with and without S9 rat liver microsome fraction.With S9 addition,plus cofactors it is possible to demonstrate compounds with genotoxic action after metabolism by liver enzymes.Results and confirmation of a suspected genotoxic substance are obtained in 24 hours.These operationa

44、l procedures require minimal technical or microbiological training.Most importantly,Mutatox is unlike most genotoxicity assays because the assay is available on demand and requires no preculture of test organisms.微生物学检测法的评价微生物学检测法的评价简便简便灵敏灵敏快速快速经济经济微生物检测方法不能代替哺乳动物的毒性实验微生物检测方法不能代替哺乳动物的毒性实验微生物检测在大范围的毒性污染调查中有其独微生物检测在大范围的毒性污染调查中有其独特优势。特优势。哺乳动物与人类更为接近，其实验结果的指导意哺乳动物与人类更为接近，其实验结果的指导意义更大。义更大。Thanks for your presence and advice！