高效液相色谱检测器课件.ppt

1、1第十二(3)章 高效液相色谱法High Performance Liquid ChromatographyHPLC23液相色谱仪（2）4液相色谱仪（3）5北京瑞利北京瑞利6 12(3)-1概述 高效液相色谱是在高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱气相色谱和经典色谱的的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的色谱比经典液相色谱有较高的效率效率 和实现了和实现了自自动化动化 操作。操作。高效液相色谱法是继气相色谱之后，高效液相色谱法是继气相色谱之后，70

2、年代年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.7高效液相色谱高效液相色谱经典色谱经典色谱8 经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法相色谱法引用了气相色谱的理论引用了气相色谱的理论，流动相改为流动相改为高压输送高压输送（最高输送压力可达（最高输送压力可达4.5 107Pa）;色谱色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板从而使柱效大大高于经

3、典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高高压、高速、高效或现代液相色谱法。压、高速、高效或现代液相色谱法。9 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相相固定相和流动相组成固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键吸附剂、化学键合固定相合固定相（

4、或在惰性载体表面涂上一层液膜）、（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。进行分离。12(3)-1概述一、液相色谱分离原理及分类一、液相色谱分离原理及分类10 液相液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶与溶剂（即流动相或洗

5、脱液）以及固定相分子间的剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。12(3)-1概述 根据分离机制不同，液相色谱可分为：根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。交换色谱以及分子排阻色谱等类型。11二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用液相色谱所用基本概念基本概念：保留值、塔板数、塔保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。板高度、分离度、选择性等

6、与气相色谱一致。液相液相色谱所用色谱所用基本理论基本理论：塔板理论与速率方程也与气相塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。色谱基本一致。但由于在液相色谱中以但由于在液相色谱中以液体液体代替气代替气相色谱中的相色谱中的气体气体作为流动相，而液体和气体的性质作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条仪器设备和操作条件件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：有一定差别，主要有以下几方面：12 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不气相色谱仅能分析在操作温度下能气化

7、而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析的有机物能用气相色谱分析；液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，

8、大约离分析，大约占有机物的占有机物的70 80%。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较（1 1）应用范围不同）应用范围不同13 因为：因为：气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。分子只与固定相相互作用。而而在液相色谱中流在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选种

9、或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。择性。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较（2 2）液相色谱能完成难度较高的分离工作）液相色谱能完成难度较高的分离工作14液相色谱固定相类型多液相色谱固定相类型多,如如离子交换色谱离子交换色谱和排阻色谱等和排阻色谱等，作为分析时选择余地，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。大；而气相色谱并不可能的。液相色谱通常在室温下操作，较低的温液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。度，一般有利于色谱分离条件的选择。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较15（3）由于液体的扩散系数比气体的

10、小）由于液体的扩散系数比气体的小105倍，因倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就柱外效应就显得特别重要显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。张可以忽略不计。（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备适合于大量制备。液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。技术是互相补充的。二、液相

11、色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较16 综上所述，高效液相色谱法具有综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。环保、农业等科学领域获得广泛的应用。12(3)-1概述1712(3)12(3)2 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪1812(3)12(3)2 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液

12、相色谱仪的结构示意见图，一般可分高效液相色谱仪的结构示意见图，一般可分为为4 4个主要部分：个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。系统和检测系统。此外还配有此外还配有辅助装置辅助装置：如梯度：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行

13、分离，然后依先后顺序进入检时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。此得到液相色谱图。19贮液器高压泵检测器梯度淋洗装置色谱柱压力表进样器馏分收集器高压输液系统，进样系统，高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统分离系统和检测系统20高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统2122 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高

14、压输液系统。它是仪器最重要的必须配备有高压输液系统。它是仪器最重要的部件：由储液罐、部件：由储液罐、高压输液泵高压输液泵*、过滤器、压、过滤器、压力脉动阻力器等组成。力脉动阻力器等组成。对高压输液泵的要求：对高压输液泵的要求：密封性好，输出流密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。换溶剂及耐腐蚀等要求。1.高压输液系统高压输液系统 12(3)12(3)2 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪23 常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵恒流泵和恒压泵两种。两种。12(3)12(3)2 2 高效液相色谱仪高效液相色谱

15、仪恒流泵恒流泵特点是在一定操作条件下，特点是在一定操作条件下，输出流量保持输出流量保持恒定恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵恒压泵是指能保持是指能保持输出压力恒定，输出压力恒定，但其流量则随但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍恒流泵分机械注射泵和恒流泵分机械注射泵和机械往复泵机械往复泵*两种两种24高压输液泵：高压输液泵：主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150450105 Pa。为了获得高柱效而使用粒

16、度很小的固定相为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。点之一。252进样系统进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约多（约5-30cm5-30cm），所以柱外展宽（又称），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死进样系统、连接管道及检测器中存在死体

17、积体积。进样系统是引起柱前展宽的主要。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此因素，因此高效液相色谱法中对进样技高效液相色谱法中对进样技术要求较严。术要求较严。26 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：27准备状态准备状态进样状态进样状态流动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品出口样品出口样品入口样品入口流动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品环样品环283 分离系统分离系统色谱柱色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑

18、的聚合材料的其他锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长一般色谱柱长5 530cm30cm，内径为，内径为4 45 5mmmm。一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个前置柱前置柱，前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技术的性能不受影响保证分离技术的性能不受影响。29 柱子装填得好坏对柱效影响很

19、大。对于细柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。冲洗后，即可备用。对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分析速度快等。析速度快等。3031使用色谱柱注意事项：使用色谱柱注意事项：1 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤，溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤，防止堵塞。防止堵塞。2 加前置柱。加前置柱。3 更换流动相要渐变。更换流动相要渐

20、变。4 用后要保护好。用后要保护好。324检测系统检测系统 HPLC与与GC一样，要求检测器灵敏度高，重一样，要求检测器灵敏度高，重现性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，现性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应用范围广，线性范围宽等优点应用范围广，线性范围宽等优点 检测器分为两大类：一类是检测器分为两大类：一类是溶质性检测器溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器紫外、荧光、电化学检测器等。等。另一类是另一类是总体检测器总体检测器，它对试样和洗脱液总的，它对试样和洗脱液

21、总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示示差折光，电导检测器差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍等。现将常用的检测器介绍如下如下:33HPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基于待中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。比尔定律。高效液相色谱检测器：高效液相色谱检测器：（1）紫外光度检测器紫外光度检测器（UV）优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的

22、变化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用于痕量分析。最小检测量于痕量分析。最小检测量10-9gmL-1。34高效液相色谱检测器：高效液相色谱检测器：（1）紫外光度检测器紫外光度检测器（UV）缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无吸收。吸收。35光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，

23、如图所示。波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。36 检测器是一种通用型检测器。它的作用原检测器是一种通用型检测器。它的作用原理是理是纯流动相与包含样品的流动相之间的折射纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同，率不同，检测器把这种差值检测出来，给出信检测器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。号，信号的大小与样品含量成正比。纯流动相与待测组分的折射率相差越大，纯流动相与待测组分的折射率相差越大，检测器灵敏度越高，灵敏度可达检测器灵敏度越高，灵敏度可达1010-7-7g gcmcm-3-3。通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主要

24、缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。（3）荧光检测器荧光检测器（4）电导检测器）电导检测器 （2）示差折光率检测器示差折光率检测器37 它包括它包括脱气脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 .HPLCHPLC梯度淋洗与梯度淋洗与GCGC中的程序升温一样。中的程序升温一样。对于某些复杂样品，组分的对于某些复杂样品

25、，组分的kk范围很宽，用范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采用梯度淋洗。就是用梯度淋洗。就是组成流动相的两种或两种以上组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂按一定程序改变配比、极性、不同的溶剂按一定程序改变配比、极性、pHpH、离、离子强度子强度、通过流动相极性的变化来改变待分离样、通过流动相极性的变化来改变待分离样品的选择因子和品的选择因子和t tR R，提高分离效果和分析速度。，提高分离效果和分析速度。5、附属系统、附属系统38梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，将利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定

26、两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。合后进入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,通过比例通过比例调节阀调节阀,将两种或多种不同将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。入高压泵中混合。3912(3)-3高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相（）固定相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为可分为刚性固体和硬胶刚性固体和硬胶两大类。两大类。刚性固体刚性固体以二氧化以二氧化硅为基质，可承受硅为基质，可承受7.O1081.O10

27、9Pa的高压，的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相键合固定相，可，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类全多孔型固定相两类

28、。401.表面多孔型固定相表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。厚度薄，最大允许量受限制。41

29、2全多孔型固定相 它由直径为它由直径为10m的的硅胶微粒凝聚而成硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（这类固定相由于颗粒很细（510m），），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析.42（二）流动相（二）流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：剂的要

30、求是：（1 1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。和良好的选择性。（2 2）溶剂要与检测器匹配。溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长截止波长要长。要长。所谓溶剂的所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表中列出了一些常用溶剂的紫外截止的

31、吸收测量。表中列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。波长。43 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。44（3 3）高纯度）高纯度。由于高效液相色谱灵敏度高，对流。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生不稳，或产生“伪峰伪峰”。痕量杂质的存在，将使截。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加止波长值增加50501OO nm1OO nm。（4 4）化学稳定性好）化学稳定性好。不能选与样品发生反应

32、或聚。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。合的溶剂。(5)(5)低粘度低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离响分离.45流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性 （1）可显著改变组分分离状况的流动相选择可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相在液相色谱中显得特别重要。色谱中显得特别重要。液相色谱

33、的流动相又称为：淋洗液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。液，洗脱剂。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性，极性柱也称正相柱。柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。分离柱上的出峰顺序相反。46流动相组成流动相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分

34、为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。471.吸附色谱吸附色谱（液（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是，如

35、硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2.分配色谱分配色谱（液液-液分配色谱）：早期通过在载体上涂渍液分配色谱）：早期通过在载体上涂渍一薄层固定液制备固定相一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。12(3)-4高效液相色谱法的主要类型及选择高效液相色谱法的主要类型及选择HPLC根据分离机理的不同分为几种类型：根据分离机理的不同分为几种类型：48高效液相色谱

36、法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型3.离子交换色谱离子交换色谱：固定相为离子交换树脂固定相为离子交换树脂，流动相为流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.凝胶色谱凝胶色谱（空间排阻色谱）：以凝胶为固定相。凝（空间排阻色谱）：以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯

37、凝胶等硬质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；4912(3)-4高效液相色谱法的主要类型及选择高效液相色谱法的主要类型及选择一、液一液分配色谱法（一、液一液分配色谱法（LLPC）在液在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体液色谱中，流动相和固定相都是液体,它能它能适用于各种样品类型的分离和分析适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。子型的化合物。1分离原理分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶

38、的液体中溶解度的不都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。从而能分离各种复杂组分。50 2、固定相、固定相 由于液液色谱中由于液液色谱中流动相流动相参与选择竞争，因此，参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常

39、用的强极性固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液定液，一氧二丙腈一氧二丙腈，中等极性的，中等极性的聚乙二醇聚乙二醇，非极，非极性的性的角鲨烷角鲨烷等。等。为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了了化学键合固定相化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱可以认为它的出现是液相色谱法

40、的一个重大突破法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，定相。据统计，约有约有3/4以上的分离问题是在化学以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。详细介绍见后。键合固定相上进行的。详细介绍见后。513流动相流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为将其

41、分为正相分配色谱正相分配色谱和和反相分配色谱反相分配色谱。如果采用如果采用流动相的极性小于固定相的极性流动相的极性小于固定相的极性，称为称为正相分配色谱正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。，它适用于极性化合物的分离。其其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用如果采用流动相的极性大于固定相的极性流动相的极性大于固定相的极性，称为称为反相分配色谱反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分。它适用于非极性化合物的分离，其离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。流出顺序与正相色谱恰好相反。52二、化学键合相色谱法（CBPC）采用采用化学键合相的液相色谱称

42、为化化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子用于分离容量因子k k值范围宽的样品。由值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。分离。531键合固定相类型键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅硅胶胶。利用硅胶表面的硅醇基。利用硅胶表面的硅醇基

43、(SiSi一一OH)OH)与有机分与有机分子可成键子可成键,即可得到各种性能的固定相。一般即可得到各种性能的固定相。一般可分三类可分三类（1 1）疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷烃（C C8 8和和C C1818）和苯基等和苯基等（2 2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰基、醚和醇等。如氨丙基，氰基、醚和醇等。（3 3）离子交换基团离子交换基团 如作为阴离子交换基团的如作为阴离子交换基团的胺基，季胺盐；作为阳离子交换基团的磺酸基胺基，季胺盐；作为阳离子交换基团的磺酸基等等.542反相健合相色谱法 此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如

44、硅胶一如硅胶一C18H37、硅胶一、硅胶一苯基苯基等；流动相是采用等；流动相是采用极性较强的溶剂，如极性较强的溶剂，如甲醇甲醇水、乙腈一水、水和水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等。无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；若它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；若采用水和无机盐的也可用于分离极性化合物；若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法如有机酸、有机碱、酚类等

45、。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。553.正相键合相色谱法正相键合相色谱法 此法是以极性的有机基团，此法是以极性的有机基团，CN、NH2双羟基等键合在硅胶表面作为固定相；而以双羟基等键合在硅胶表面作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离极性化合物。此时，动相，分离极性化合物。此时，组分的分配组分的分配比比k值随其极性的增加而增大，但随流动相值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。极性的增

46、加而降低。这种色谱方法主要用于分离异构体、这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。型的化合物。564.离子性键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一各种离子交换基团，如一SOSO3 3H H 一一CHCH2 2NHNH2 2、C00HC00H等时，等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。分离原理与离子交换色谱类同。以上讨

47、论了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合以上讨论了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合相色谱的最大优点是：相色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有8O8O的分离问题是用键合相色谱法解决。此法的最大缺的分离问题是用键合相色谱法解决。此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲

48、溶液作点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。流动相的体系。57 58三、液一固吸附色谱法三、液一固吸附色谱法(LSAC)LSAC)液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的的。1分离原理分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。

49、同时，剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（当试样分子（X）被流动相带入柱内，与流动相）被流动相带入柱内，与流动相溶剂分子（溶剂分子（S）在固定相表面发生竞争吸附）在固定相表面发生竞争吸附:X+nS吸附吸附=X吸附吸附+nS59 X+nS吸附吸附=X吸附吸附+nS达平衡时，有达平衡时，有 nnSXSXK吸附吸附其中其中K为吸附平衡常数为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。保留强，难于洗脱。K值小值小,则保留值弱，易于洗脱。则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。试样中各组分据此得以分离。K值可通过吸附等温值可通过吸附等温线数据求

50、出。线数据求出。602固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化硅胶、氧化铝、聚酸胶铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，等。由于硅胶的优点较多，因此，以硅胶用得最多。因此，以硅胶用得最多。在高效液相色谱法中，表面多孔型在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，目前最广泛使用的还是目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填全多孔型微粒填料。料。613、流动相流动相 一般把吸附色谱中一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采