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1、肝脏毒理学试验肝脏毒理学试验-肝细胞灌流、肝细胞灌流、肝肝脏脏匀浆匀浆试试验验1概概 述述肝脏毒理学：肝脏毒理学：利用毒理学的基本原理和方法，研究外源因子利用毒理学的基本原理和方法，研究外源因子 对对肝脏的损害作用及其机肝脏的损害作用及其机制制的学科。的学科。化学性肝损伤：化学性肝损伤：化学物引起的各种化学物引起的各种急性急性和和慢性肝损伤慢性肝损伤。急急性暴露性暴露：脂质蓄积、脂质蓄积、坏死、坏死、肝胆功能障碍肝胆功能障碍慢性暴露慢性暴露：纤维化、纤维化、肝硬化肝硬化瘤样改变瘤样改变School of Public Health2解解 剖剖 位位 置置School of Public Hea

2、lth3第三第三节节 化学性肝损伤的检测与评价化学性肝损伤的检测与评价School of Public Health4肝损伤的体外试验肝损伤的体外试验School of Public Health51.离体灌流肝试验离体灌流肝试验2.肝匀浆试验肝匀浆试验3.肝薄片孵育试验肝薄片孵育试验4.原代肝细胞培养试验原代肝细胞培养试验5.肝细胞（株）试验肝细胞（株）试验6 6小鼠肝灌流试验小鼠肝灌流试验一一 实验目的与用途实验目的与用途71、目的：、目的：练习小鼠肝灌流，分离提练习小鼠肝灌流，分离提取取原原代代肝肝细细胞胞 掌握掌握肝脏匀浆方法肝脏匀浆方法2、用途：、用途：体外研体外研究究肝脏药物毒性、

3、代谢肝脏药物毒性、代谢、细胞细胞相相互互作作用用肝细胞移肝细胞移植植和和人工肝支人工肝支持持系统系统转基因、基因敲除动转基因、基因敲除动物物分离肝分离肝细细胞胞肝灌流方法肝灌流方法1976年年Seglen等大鼠经等大鼠经门静脉置门静脉置管管胶原酶两步灌胶原酶两步灌 注法：注法：先灌注先灌注无无Ca2+溶液溶液进行细胞分离；进行细胞分离；再用含再用含有有胶原酶的胶原酶的Ca2+灌流液灌流液进行细胞消化进行细胞消化小鼠存在困难：小鼠存在困难：门静脉置管困门静脉置管困难难、灌、灌注注不不均匀均匀故很多实验采用故很多实验采用心尖置管心尖置管对小对小鼠鼠进行进行肝肝灌灌流流提提取取 原代肝细胞。原代肝细

4、胞。8二二 实验器材实验器材仪器准备：仪器准备：恒流泵（恒流泵（5ml注射器注射器），硅胶管（），硅胶管（3mm，4mm）剪刀、镊子、止血钳、剪刀、镊子、止血钳、头皮采血针头皮采血针、1ml注射器，注射器，缝合线（缝合线（0.04mm)，托盘，解剖板、匀浆器；，托盘，解剖板、匀浆器；细胞计数板、计数器，培养板细胞计数板、计数器，培养板（I型胶原蛋白包被）型胶原蛋白包被）离心机离心机，50ml烧杯烧杯2个个、500ml烧杯烧杯2个，培养皿，离心个，培养皿，离心 管（管（4ml），），200目过滤网筛等目过滤网筛等9三三 实验试剂实验试剂10配制：配制：I.I.戊巴比妥钠戊巴比妥钠（50mg/kg

5、）II.II.无无 钙钙 灌灌 流流 液液 ：pH7.4 NaCl：8.3g/L；KCl：0.5g/L；HEPES：2.4g/L；EGTA：0.38g/L，用，用 适量超纯适量超纯H2O溶解溶解，1 molL-1NaOH调节调节pH至至7.4，定容定容至至1LIII.0.025%胶胶 原原 酶酶 灌灌 流流 液液 ：pH7.6 NaCl：3.9g/L；KCl：0.5g/L；HEPES：2.4g/L；CaCl2(无无水水)：0.55g/L，适量超纯适量超纯H2O溶解溶解，1 molL-1NaOH 调调pH至至7.6，定容定容至至1L，临临用用前前按按 加入胶原酶加入胶原酶IV0.25mg/mlI

6、V.细胞洗涤液：细胞洗涤液：pH7.4NaCl：8.3g/L；KCl：0.5g/L；HEPES：2.4g/L；CaCl2(无无水）水）140mg/L，1M NaOH：5.5ml/L四四 操作前准备操作前准备11Day 1：I.I.试剂、手术器试剂、手术器械械高压灭菌高压灭菌II.II.无菌条件下无菌条件下I型胶原蛋白包被细胞培养型胶原蛋白包被细胞培养皿皿III.III.配制配制DMEM高糖培养基高糖培养基四四 操作前准备操作前准备12Day 2：准备物品准备物品，70%酒精消毒灌流系酒精消毒灌流系统统，后用，后用无菌水冲无菌水冲洗洗，流，流速速3.5-4 mL/min。40ml无钙、无钙、30

7、ml有钙灌流液有钙灌流液（0.2mg/mL胶原酶胶原酶IV）37预热预热。禁食，禁食，麻醉，按小鼠体积的麻醉，按小鼠体积的2%注射戊巴比妥钠注射戊巴比妥钠细胞消化液细胞消化液（现配现用）（现配现用）0.9mg collagenase IV+蛋白酶蛋白酶 2mg+DNA酶酶1mg加入加入5ml 灌流液中混匀。灌流液中混匀。五五 肝细胞分离肝细胞分离Day 2：1.1.连接无钙灌流液溶液连接无钙灌流液溶液，排排 净空净空气气。2.2.小鼠四肢小鼠四肢固定固定，消毒消毒，剪，剪 开胸腔，露出肝脏开胸腔，露出肝脏，暴露暴露 心心尖尖 ，由，由左心室进针左心室进针，用，用 止血钳夹紧针头止血钳夹紧针头，

8、开始灌，开始灌 流。流。3.3.硅胶管硅胶管和头皮针相连，打和头皮针相连，打 开灌流器，流量调低开灌流器，流量调低133.3.剪开小鼠剪开小鼠股动脉股动脉(右侧右侧)，观察肝，观察肝 脏由鲜红色逐渐变白然后呈浅黄脏由鲜红色逐渐变白然后呈浅黄 色，且股动脉有液体流出色，且股动脉有液体流出4.4.调速度至调速度至3-4mL/min，无钙灌流，无钙灌流 液灌流液灌流5.5.灌流含灌流含IV胶原酶灌流液。胶原酶灌流液。14五五 肝细胞分离肝细胞分离7.7.肝脏变白成乳糜肝脏变白成乳糜状状停止，剥离肝脏，置停止，剥离肝脏，置 有细胞洗涤液平皿有细胞洗涤液平皿8.开始在细胞房操作开始在细胞房操作：用眼科镊

9、撕去肝包用眼科镊撕去肝包 膜，轻轻振摇。尽量轻柔，避免细胞受膜，轻轻振摇。尽量轻柔，避免细胞受 伤。除杂组织，伤。除杂组织，形成肝细胞悬液。形成肝细胞悬液。9.肝细胞悬液和组肝细胞悬液和组织织倒入消化液倒入消化液中，置于中，置于37恒温箱中轻微振荡消化处恒温箱中轻微振荡消化处理理30min。(加入加入DNA酶是因为酶是因为DNA有粘着有粘着性性，防，防止止细胞聚细胞聚集粘集粘 着，在此期间，受损伤肝细着，在此期间，受损伤肝细胞胞进一进一步步排出排出其其内容内容 物而变得更轻，易于在离心物而变得更轻，易于在离心时时与完与完整整细胞细胞分分开开）观看观看 视频视频15五五 肝细胞分离肝细胞分离16

10、10.消化处理后，肝细胞液消化处理后，肝细胞液用用200目滤网过目滤网过滤滤，再加入培养液再加入培养液终止终止，600g 5min，离心三次，离心三次，肝细胞较重肝细胞较重沉于试管底部沉于试管底部，用，用PBS冲洗冲洗1-2次，次，显微镜下显微镜下细胞计数细胞计数。六六 细胞活力细胞活力的的测定测定170.6台盼蓝台盼蓝（trypan blue）与肝细胞悬液以与肝细胞悬液以1:1比例混匀，光学显微镜下计比例混匀，光学显微镜下计数数。细胞活细胞活率率：能够：能够排出台盼排出台盼蓝蓝而不被染色而不被染色活率要求在活率要求在80%以上以上七七 细胞培养细胞培养肝细胞以肝细胞以5105每毫升，接种于培

11、养每毫升，接种于培养板板37 5%CO2的孵育箱内孵育的孵育箱内孵育3-4 h后，待细胞基本贴壁，后，待细胞基本贴壁，更换培养液（含更换培养液（含1uM氢化可的松琥珀酸氢化可的松琥珀酸酯酯及及BSA 240ug/ml）其后每其后每24 h换液一次。换液一次。18肝星状细肝星状细胞胞 梭形梭形肝细肝细胞胞 岛屿状岛屿状糖原染色糖原染色细胞免疫化学染细胞免疫化学染色色 （CK-8）19八八 鉴定鉴定-形态形态CYP450酶系的活性和表达量（酶系的活性和表达量（0h/42h/90h)。20八八 鉴定鉴定-酶活酶活九九 注意事项注意事项21速度速度不能太快不能太快，肝脏不能涨起，肝脏不能涨起灌注时灌注

12、时避免气泡避免气泡心尖进针灌流心尖进针灌流3-5分钟分钟（应迅速应迅速，开胸小鼠，开胸小鼠2min内死亡血液内死亡血液 凝固）。凝固）。肝脏肝脏匀匀浆试验浆试验1.1.取出肝脏，取出肝脏，生理盐水生理盐水洗洗23次次，去结缔组织和脂肪。，去结缔组织和脂肪。2.2.称称肝组肝组织织0.2 g剪碎，置入玻璃匀浆器，剪碎，置入玻璃匀浆器，1.8mL生理盐生理盐 水水匀浆（匀浆（冰上操作冰上操作）。）。左手持匀浆管将下端插入冰盒中保持低温状态，右手将捣左手持匀浆管将下端插入冰盒中保持低温状态，右手将捣 杵垂直插入套管中，上下转动研磨数十次杵垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6-8分钟），充分分钟），

13、充分 研碎，使组织匀浆化，看不到纤维状物质为止。研碎，使组织匀浆化，看不到纤维状物质为止。3.3.移入离心管，移入离心管，2倍生理盐水洗涤匀浆器倍生理盐水洗涤匀浆器，2000rpm离心离心15 min后，取上清，备用。后，取上清，备用。BCA法测蛋白浓法测蛋白浓度度 （OD法）法）基本原理：碱性条件下，蛋白基本原理：碱性条件下，蛋白将将Cu2+还原还原为为Cu+，Cu+与与 BCA试剂形成试剂形成紫色紫色的络合物，测定其在的络合物，测定其在570nm处的吸收值处的吸收值，并与标并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。1.1.配标准曲线（要做复孔）配标准曲线

14、（要做复孔）BSA标准品标准品15 l+0.9%NaCl 135l=150 l2.20ul的体系的体系（18 l NaCl+2 l待测样品）待测样品），复孔，复孔3.A B 液以液以50：1配配制制，每，每孔孔加加入入200 l（此操作需要避光）锡箔纸（此操作需要避光）锡箔纸包包裹裹，37 孵育半小时孵育半小时4.4.用酶标仪检测用酶标仪检测（570nm波长波长检检测测）23实验报告实验报告 1.实验目的意义；实验目的意义；2.实验动物的种属、品系、性别、体重；实验动物的种属、品系、性别、体重；3.实验步骤；实验步骤；4.实验结果；实验结果；5.分析与讨论分析与讨论 思考题：思考题：1.肝脏毒

15、理学试验包括哪些种类的试验？举例说明肝脏毒理学试验包括哪些种类的试验？举例说明 2.肝脏灌流后原代肝细胞的用途？肝脏灌流后原代肝细胞的用途？肝脏肝脏匀匀浆试验浆试验1.1.取出肝脏，用生理盐水取出肝脏，用生理盐水洗洗23次，次，除去血液除去血液，剥掉表面的，剥掉表面的 结缔组织的脂肪。结缔组织的脂肪。2.2.称取称取肝组织肝组织0.2 g，玻璃匀浆器剪碎，加，玻璃匀浆器剪碎，加入入9倍体积倍体积（mL）的生理盐水进行匀浆（的生理盐水进行匀浆（冰上操冰上操作作）。）。左手持匀浆管将下端插入冰左手持匀浆管将下端插入冰盒中保持低温状态，右手将捣杵垂直插入套管中，上下转动研磨十次（盒中保持低温状态，右

16、手将捣杵垂直插入套管中，上下转动研磨十次（6-8分分钟），充分研碎，使组织匀浆化，看不到纤维状物质为止。钟），充分研碎，使组织匀浆化，看不到纤维状物质为止。3.3.肝匀浆装入离心管内（肝匀浆装入离心管内（1/3左右），用左右），用23倍量生理盐水洗倍量生理盐水洗 涤涤，2000rpm离心离心15 min后，取上清，备用。后，取上清，备用。操作流程操作流程262%体积注射麻醉、体积注射麻醉、固定小鼠固定小鼠消毒腹部、打开腹腔消毒腹部、打开腹腔胸腔，暴露心尖胸腔，暴露心尖头皮针左心室进针，头皮针左心室进针，止血钳夹紧，止血钳夹紧，5ml注注 射器灌流，总体积射器灌流，总体积 25ml待肝脏由红变白

17、，完待肝脏由红变白，完 整取下肝脏称重，生整取下肝脏称重，生 理盐水清洗，取理盐水清洗，取0.2g，1.8ml生理盐水匀生理盐水匀浆浆待用待用肝脏毒理学肝脏毒理学-概概 述述肝脏毒理学：肝脏毒理学：利用毒理学的基本原理和方法，研究外源化学利用毒理学的基本原理和方法，研究外源化学 物对物对肝脏的损害作用及其机肝脏的损害作用及其机制制的学科。的学科。化学性肝损害：化学性肝损害：化学物引起的各种化学物引起的各种急性急性和和慢性肝损害慢性肝损害。急急性暴露性暴露：脂质蓄积、脂质蓄积、坏死、坏死、肝胆功能障碍肝胆功能障碍慢性暴露慢性暴露：纤维化、纤维化、肝硬化肝硬化瘤样改变瘤样改变School of P

18、ublic Health27肝脏作为毒作用靶器官肝脏作为毒作用靶器官肝脏作为毒作用靶器官的原因特殊的解剖位置特殊的解剖位置组织结构组织结构生理生化特性生理生化特性School of Public Health28解解 剖剖 位位 置置29解解 剖剖 位位 置置30组组 织织 结结 构构31人正常肝细胞人正常肝细胞，HE，低倍，低倍肝的基本单位肝的基本单位肝小肝小叶叶是肝结构和功能的基本单位，呈多面棱柱状。在肝小叶是肝结构和功能的基本单位，呈多面棱柱状。在肝小叶中央有中央有 一纵行中央静脉。一纵行中央静脉。肝细胞以肝细胞以中央静脉中央静脉为中心，向四周略呈放射状排列，形为中心，向四周略呈放射状排

19、列，形成成肝细肝细 胞素（板）。胞素（板）。肝细胞素之间是肝细胞素之间是肝血窦肝血窦。肝血窦腔内有。肝血窦腔内有库普弗细库普弗细胞胞，具有吞噬，具有吞噬 功能。功能。相邻两肝细胞之间有相邻两肝细胞之间有胆小管胆小管。胆小管可将肝细胞分泌的胆汁汇。胆小管可将肝细胞分泌的胆汁汇 集至肝小叶周边的小叶间胆管内。集至肝小叶周边的小叶间胆管内。School of Public Health32肝的基本单位肝的基本单位肝腺泡肝腺泡：带氧浓度带氧浓度、胆盐、酶分布及、胆盐、酶分布及活性不同活性不同带带带带 带带School of Public Health33肝腺泡肝腺泡氧浓度较高氧浓度较高 富含线粒体富含

20、线粒体 谷胱甘肽谷胱甘肽氧浓度较低氧浓度较低 细胞色素细胞色素 P450含量含量 高高带带School of Public Health34带带带带处于中间状态处于中间状态（二（二）肝脏肝脏细胞细胞35肝肝细胞细胞：体体积大，积大，多多面体，面体，细细 胞胞核圆大核圆大居居中，浅中，浅染染，核核仁清楚仁清楚，过氧化过氧化物物 酶酶等细胞等细胞器器丰富，丰富，富富 含含糖原、糖原、脂脂滴滴。（三（三）肝脏肝脏生生理生理生化化功功能能School of Public Health361.分泌胆汁分泌胆汁，促进脂肪和脂质的消化和吸收，促进脂肪和脂质的消化和吸收2.内分泌作内分泌作用用，合成清蛋白、纤

21、维蛋白原，合成清蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原等蛋凝血酶原等蛋白白3.物质和能量代谢物质和能量代谢4.解毒和吞噬防御解毒和吞噬防御5.造血造血第二第二节节 肝对外源化学物的毒性反应与机制肝对外源化学物的毒性反应与机制1急性肝损急性肝损害害：肝细胞坏死、肝细胞坏死、脂肪变性、脂肪变性、胆汁淤积胆汁淤积2School of Public Health37慢性肝损害慢性肝损害：肝纤维化、肝纤维化、肝肝硬化、硬化、癌变癌变根据损伤发生的快慢根据损伤发生的快慢一、肝细胞死亡一、肝细胞死亡细胞坏死：细胞坏死：细胞肿胀，渗细胞肿胀，渗 漏，核崩溃，漏，核崩溃，细胞膜破裂，细胞膜破裂，炎症炎症,仅涉及分仅涉及分

22、散的单个细胞散的单个细胞细胞死亡细胞死亡School of Public Health38细胞凋亡细胞凋亡：细胞收缩，核片细胞收缩，核片 段化，凋亡小体段化，凋亡小体 形成，无炎形成，无炎症症.，坏死影响肝小叶坏死影响肝小叶 的大部分区域的大部分区域一、肝细胞死亡一、肝细胞死亡School of Public Health39二、脂肪变性二、脂肪变性脂肪肝脂肪肝脂滴脂滴School of Public Health40二、脂肪变性二、脂肪变性School of Public Health41三、胆汁淤积三、胆汁淤积表现：表现：胆汁形成减少，胆汁分泌与排胆汁形成减少，胆汁分泌与排泄泄受阻受阻胆小

23、管肿胀，胆栓形成，肝细胆小管肿胀，胆栓形成，肝细胞胞肿胀肿胀、死死亡亡和炎症和炎症血清中胆盐和胆红素含量增加血清中胆盐和胆红素含量增加胆红素在胆道排泄受阻时，可胆红素在胆道排泄受阻时，可在在皮肤皮肤和和眼眼睛睛沉积，沉积，产生黄疸产生黄疸胆红素从尿液排出，胆红素从尿液排出，尿液黄色或深褐色尿液黄色或深褐色评价胆道排泄功能：磺溴酞钠评价胆道排泄功能：磺溴酞钠School of Public Health42四、肝纤维化与肝硬化四、肝纤维化与肝硬化表现：广泛的纤维组织蓄积表现：广泛的纤维组织蓄积特点：致命性和不可逆性特点：致命性和不可逆性School of Public Health43正常肝正常

24、肝脏脏肝硬化肝硬化44肝硬化，肝硬化，HE，低倍，低倍六、肝癌变六、肝癌变毒性机制毒性机制：毒物及其代谢产物毒物及其代谢产物对对生物大分子损生物大分子损伤伤与生物大分与生物大分子子共价结合共价结合活化癌基因活化癌基因抑制抑癌基因抑制抑癌基因School of Public Health45肝细胞癌肝细胞癌46肝脏肝脏受损受损 的过程的过程47第三第三节节 化学性肝损伤的检测与评价化学性肝损伤的检测与评价School of Public Health48一、体内试验评价一、体内试验评价Section1School of Public Health49Section2Section3Section

25、4活性升高反活性升高反 映胆汁淤积映胆汁淤积 型肝损伤：型肝损伤：碱碱性磷性磷酸酸酶酶、-谷谷氨氨酰酰转转肽酶肽酶活性升高反活性升高反 映细胞毒性映细胞毒性 肝损伤肝损伤:谷草转氨酶谷草转氨酶5-5-核核苷酸苷酸酶酶、乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶苹果酸脱苹果酸脱氢酶、氢酶、谷丙转氨谷丙转氨酶、酶、谷氨酸脱谷氨酸脱氢酶氢酶对肝损伤对肝损伤 不敏感，不敏感，对肝外细对肝外细 胞损伤敏胞损伤敏 感：感：肌酐磷酸肌酐磷酸 激酶激酶活性降低活性降低 反映肝细反映肝细 胞损伤胞损伤：胆碱酯酶胆碱酯酶（一）血清酶学检测（一）血清酶学检测（二（二）肝脏肝脏匀匀浆后浆后生生化检化检测测School of Public

26、Health501.甘油三酯：甘油三酯：肝脏脂肪变性的常规指标肝脏脂肪变性的常规指标2.葡萄葡萄糖糖 6磷酸酶（磷酸酶（G-6-P）：）：与内质网完整性有关与内质网完整性有关3.肝胶原（羟脯氨酸肝胶原（羟脯氨酸）：）：肝脏纤维化的指标肝脏纤维化的指标4.脂质过氧化物（丙二醛）：脂质过氧化物（丙二醛）：氧化损伤的程度氧化损伤的程度5.DNA加合物加合物（三（三）肝脏肝脏组组织病织病理理学检学检查查School of Public Health511.一般检查一般检查2.光镜检查光镜检查3.电镜检查：超微结构电镜检查：超微结构肝损伤的体外试验肝损伤的体外试验1.离体灌流肝试验离体灌流肝试验2.肝匀

27、浆试验肝匀浆试验3.肝薄片孵育试验肝薄片孵育试验4.原代肝细胞培养试验原代肝细胞培养试验5.肝细胞（株）试验肝细胞（株）试验School of Public Health52致畸胎试验致畸胎试验小鼠小鼠11.24孕马血清孕马血清(10 IU)11.26人绒毛膜促性腺激人绒毛膜促性腺激素素(10 IU)(非必需非必需)11.2711.2812.612.15合笼合笼G0G9皮下注射环磷皮下注射环磷酰酰胺胺（20mg/kg）G18解解剖剖（注意观察孕龄注意观察孕龄）6人一组人一组53孕鼠处死和检查孕鼠处死和检查于自然分娩前一天称重并处死孕鼠，大鼠于自然分娩前一天称重并处死孕鼠，大鼠为为d20，小鼠，

28、小鼠d19剖腹取出子宫称重，记录剖腹取出子宫称重，记录并并检检查查黄体数、着床数、活胎数黄体数、着床数、活胎数、死胎数和吸收胎、死胎数和吸收胎数数。计算体重净增值计算体重净增值净增值净增值=妊娠妊娠20 d 孕鼠体重孕鼠体重-妊娠妊娠0 d 体重体重-怀孕子宫重怀孕子宫重54活胎鼠检查活胎鼠检查逐一记录逐一记录胎仔性别、体重、体胎仔性别、体重、体长长，检查胎鼠外观有无异常。，检查胎鼠外观有无异常。检查项目主要包括：检查项目主要包括：头部畸形：头部畸形：脑积水、露脑、无脑畸形、脑膜膨出、无眼、脑积水、露脑、无脑畸形、脑膜膨出、无眼、小眼、无耳、小耳、腭裂等；小眼、无耳、小耳、腭裂等；躯干畸形：躯

29、干畸形：如脐疝、腹裂、脊髓膨出、脊柱裂、脊柱侧突如脐疝、腹裂、脊髓膨出、脊柱裂、脊柱侧突等等四肢畸形：四肢畸形：多趾、并趾、少趾、无趾、足内翻、短肢等；多趾、并趾、少趾、无趾、足内翻、短肢等；尾畸形：尾畸形：短尾、卷尾、无尾、尾分叉等；短尾、卷尾、无尾、尾分叉等；其它：其它：如肛门闭锁等。如肛门闭锁等。55标本的制备标本的制备56大体标本：大体标本：将每窝将每窝的的 1/2活胎鼠放活胎鼠放人人Bouins液中固定液中固定2周周，行，行大体徒手切片进行内脏检查。大体徒手切片进行内脏检查。骨标本：骨标本：将每窝将每窝1/2的活胎的活胎鼠鼠去皮、去内脏及脂肪去皮、去内脏及脂肪后后，放放 人人茜素红茜

30、素红溶液染色，当天摇动玻璃溶液染色，当天摇动玻璃瓶瓶2次次3次，次，待骨骼染成红色时为止。待骨骼染成红色时为止。将胎鼠换人将胎鼠换人透明透明液液A中中1天天2天；天；换换入入透明液透明液B中中2天天3天。天。待胎鼠骨骼已染红，而软组织的紫红色基本褪待胎鼠骨骼已染红，而软组织的紫红色基本褪 去，可换去，可换置置甘油甘油中中。(剥皮法剥皮法)骨骼检查骨骼检查57头部骨骼：头部骨骼：颅顶骨颅顶骨缺损、骨化迟缺损、骨化迟缓缓 ，枕骨枕骨缺损、缺失缺损、缺失椎骨：椎骨：颈椎骨颈椎骨缺损、椎弓不连续、骨化迟缓缺损、椎弓不连续、骨化迟缓，腰腰椎椎缺缺 失、分裂变形失、分裂变形，盘骨盘骨缺失缺失，尾椎尾椎骨缺

31、失、椎骨缺失、椎 弓不连续、融合；弓不连续、融合；胸骨：胸骨：正常情况正常情况下下胸骨是胸骨是6个个，骨化迟缓或骨骼畸形，骨化迟缓或骨骼畸形 时可发生胸骨节缺损或消失，单、双骨化点时可发生胸骨节缺损或消失，单、双骨化点 或不到正常或不到正常的的12，胸骨节错位胸骨节错位等；等；肋骨：肋骨：正常大小正常大小鼠鼠肋骨为肋骨为13对对，可出现多肋、少肋、，可出现多肋、少肋、肋肋 骨分叉、肋融合、波状肋等；骨分叉、肋融合、波状肋等；四肢骨：四肢骨：观察骨化程度、粗短观察骨化程度、粗短、畸形、多趾畸形、多趾(指指)、少趾、少趾(指指)等。等。8切片顺序切片顺序下刀部位和方向下刀部位和方向横断面所见横断面

32、所见1从鼻孔下通过眼球中部向上部从鼻孔下通过眼球中部向上部 切切大脑、侧脑室、眼球、鼻中隔、鼻腔大脑、侧脑室、眼球、鼻中隔、鼻腔2把嘴打开，从舌向口角下切，把嘴打开，从舌向口角下切，向枕部切向枕部切大脑、间脑、延脑，下横断面看腭裂大脑、间脑、延脑，下横断面看腭裂3齐下颌向颈后切齐下颌向颈后切舌、鼻咽腔、延髓舌、鼻咽腔、延髓4从双肩上沿向颈后切从双肩上沿向颈后切气管、食道、胸腺气管、食道、胸腺5从前肢剪断面中央向后切从前肢剪断面中央向后切肺、纵隔、心房、脊髓肺、纵隔、心房、脊髓6从剑突下向后切从剑突下向后切肺、心室、心室中隔肺、心室、心室中隔7脐至剑突脐至剑突间间1/2处向后切处向后切肺、横膈肺

33、、横膈8从脐向后切从脐向后切肝、胃肝、胃(小部分小部分)9腹股沟至脐间腹股沟至脐间1/2处向后切处向后切胃胃(大部分大部分)、肝、十二指肠、肾上腺、肝、十二指肠、肾上腺10相当于髂骨前棘处向后切相当于髂骨前棘处向后切相当于髂骨前棘处向后切相当于髂骨前棘处向后切胃胃(小部分小部分)肝、肾、脾、胰、肠肝、肾、脾、胰、肠11(不必切，用眼科镊解剖不必切，用眼科镊解剖)生殖器、膀胱、肾生殖器、膀胱、肾5内内脏脏检检查查、内脏检查的内容内脏检查的内容59有无腭裂、舌异有无腭裂、舌异常常；有；有无鼻道无鼻道扩大、扩大、鼻中隔鼻中隔是否正常是否正常检查检查眼球眼球大小；大小；有有无脑水肿无脑水肿检查胸腹腔各

34、检查胸腹腔各脏器大脏器大小小、位置位置；有无有无心脏室间隔或瓣心脏室间隔或瓣膜膜缺损、膈疝等缺损、膈疝等检查检查肝脏有肝脏有无异常和缺失；检查有无异常和缺失；检查有无无肾积水肾积水检查检查子宫子宫有无输卵管积液；检有无输卵管积液；检查查睾丸睾丸有无异常有无异常结果分析和评价结果分析和评价60对母体对母体一般情况及体一般情况及体重重的影响；的影响；对母鼠生殖能力的影响对母鼠生殖能力的影响：孕体着床数孕体着床数、活胎数活胎数、吸收胎数吸收胎数 和和死胎数死胎数；对胎鼠外观发育的影响对胎鼠外观发育的影响：体重、身长、尾长及外观异体重、身长、尾长及外观异常常；对胎鼠骨骼发育的影对胎鼠骨骼发育的影响响(

35、骨骼畸形发生骨骼畸形发生率率)；对胎鼠内脏发育的影对胎鼠内脏发育的影响响(内脏畸形发生率内脏畸形发生率)。常用统计学方法：各种常用统计学方法：各种“率率”用用卡方检验卡方检验，体重，体重等等计量资计量资 料用方差分料用方差分析析。结果评定结果评定61根据观察到的效应和产生效应的剂量水平进行评价，主要根据观察到的效应和产生效应的剂量水平进行评价，主要 有以下两种方法。有以下两种方法。1.1.致畸指致畸指数数 =雌性动雌性动物物LD50/最小致畸剂量最小致畸剂量参考标准：致畸指数小于参考标准：致畸指数小于10为基本无致畸危害；为基本无致畸危害；致畸致畸指数大指数大于于10为有致畸危害；为有致畸危害

36、；致畸指致畸指数数大于大于100为强致畸为强致畸危害；危害；2.2.相对致畸指数相对致畸指数(RTI)：即成年动物即成年动物LD01(最小致死剂最小致死剂量量)与与诱发诱发5畸形发生率的剂量之畸形发生率的剂量之比比，比值越大，表示致畸，比值越大，表示致畸 度愈大。度愈大。注意事项注意事项62不能肯定或排除由于两性配子损不能肯定或排除由于两性配子损伤伤所引起的畸形和胚胎毒性所引起的畸形和胚胎毒性给药剂量、时间、途径、动给药剂量、时间、途径、动物物敏感性敏感性有明显影响有明显影响某些某些畸形或变异畸形或变异如多肋、短如多肋、短尾尾不影响不影响后代存活和健康后代存活和健康某些部位或器官的骨化迟缓，如胸骨、脊椎骨、趾骨、枕骨某些部位或器官的骨化迟缓，如胸骨、脊椎骨、趾骨、枕骨，可在，可在出生后赶上出生后赶上正常动物，属正常动物，属于于胚胎毒性而非畸形胚胎毒性而非畸形要求要求两种动物进行试两种动物进行试验验。思考题思考题631.1.传统致畸试验的意义和应用？有哪些不足之处？传统致畸试验的意义和应用？有哪些不足之处？2.2.了解发育毒性的替代实验？了解发育毒性的替代实验？