-操作讲义-实验八.彗星试验单细胞凝胶电泳(SCGE)课件.pptx

1、分子与细胞毒理学实分子与细胞毒理学实验验单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳(SCGE)(彗星试验彗星试验,Comet Assay)单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)又称又称彗星试验彗星试验(comet assay)是一种在是一种在单细胞水平单细胞水平上上检测检测DNA损伤与修复损伤与修复的方法的方法；原理：原理：DNA损伤时，断裂的损伤时，断裂的DNA片段比大片段片段比大片段DNA迁移的迁移的更更 快，电泳后出现彗星状，即可判断快，电泳后出现彗星状，即可判断DNA损伤损伤。根据彗星的尾长、尾密度、尾矩进行根据彗星的尾长、尾密度、尾

2、矩进行DNA链断裂的半链断裂的半定定量分量分析析极极2+极极单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)3评价评价：细胞未受损伤：细胞未受损伤：电泳中细胞核电泳中细胞核DNA(分子量大分子量大)而停留在核而停留在核基基 质中；荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现质中；荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象象DNA链断裂损伤：链断裂损伤：细胞受损，细胞受损，DNA链断裂的碎片链断裂的碎片(分子量小分子量小)，电泳时在凝胶中离开核基质向阳极迁移；电泳后出现彗，电泳时在凝胶中离开核基质向阳极迁移；电泳后出现彗星星 状拖状拖尾尾损伤细胞比例分

3、析：损伤细胞比例分析：计数定量计数定量(100个个)细胞，其中有彗星拖细胞，其中有彗星拖尾尾 的细胞比例的细胞比例(%)半定量分析：半定量分析：根据彗星的尾长、尾密度根据彗星的尾长、尾密度(荧光强度荧光强度)、尾矩进、尾矩进行行 单个细胞单个细胞DNA链断裂程度的评链断裂程度的评价价单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)应用：应用：是检测是检测DNA微损伤微损伤的新方法的新方法，在国际在国际遗传毒性检测遗传毒性检测程序工作会议上已得到认可程序工作会议上已得到认可。检测诱变剂、射线等对检测诱变剂、射线等对DNA的损伤的损伤、监测环

4、监测环境污染物对境污染物对机体的遗传损害机体的遗传损害、研究毒物研究毒物致癌致癌机制，机制，等等4特点特点：实验流程短实验流程短(一天可完成实验一天可完成实验);图像获取和数据分析可隔图像获取和数据分析可隔日日 完成完成；在单细胞水平上对在单细胞水平上对DNA损伤进行可视性检测损伤进行可视性检测；准确性好、灵敏度高准确性好、灵敏度高。5单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)实验目实验目的的6掌握掌握SCGE试验的试验的原原理理熟悉熟悉SCGE试验的试验的操作和应操作和应用用了解了解SCGE试验的试验的评价方评价方法法实验原实验原

5、理理7在在中中性性 (pH=8)条件下，核条件下，核DNA 仍保持双螺旋结构，虽偶仍保持双螺旋结构，虽偶有有 单链断裂，但并不影响单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有双螺旋大分子的连续性。只有当当 DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁迁 移，形成荧光拖尾现象，形似彗移，形成荧光拖尾现象，形似彗星星在在强碱强碱(pH13)条件下，先是条件下，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单双链解螺旋且碱变性为单链链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎碎 片离开核片离开

6、核DNA向阳性迁移，形成拖向阳性迁移，形成拖尾尾实验原实验原理理细胞细胞DNA受损愈受损愈重重其断链或断片也就愈其断链或断片也就愈小小产生断链或碱易变性断片愈产生断链或碱易变性断片愈多多 /电场作用下迁移电场作用下迁移DNA量多量多距距离离长长 尾长增加尾长增加&尾部荧光强度增尾部荧光强度增强强因此，通过测定因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定迁移部分的光密度或迁移长度可定量量 地测定单个细胞地测定单个细胞DNA损伤的程度损伤的程度。尾长在高剂量时达到饱和不再增加，而尾长在高剂量时达到饱和不再增加，而尾矩则与剂量呈尾矩则与剂量呈线线 性相关性相关。因此，在尾长、密度、面积、尾矩等

7、各项分析。因此，在尾长、密度、面积、尾矩等各项分析指指 标中，标中，尾矩尾矩能更精确地测定能更精确地测定DNA损伤损伤。8操作步操作步骤骤(1)细胞处理细胞处理(已做已做)取处于对数生长期的各细胞消化后按照取处于对数生长期的各细胞消化后按照3105/孔接种于六孔接种于六孔孔 板，板，按如下分组进行处理按如下分组进行处理：对照组对照组：用等量的用等量的NS处理处理；镉镉(CdCl2)暴露组：镉处理剂量为暴露组：镉处理剂量为10 mol/L、20 mol/L、40 mol/L)；处理时间为处理时间为24 h，终止处理后收获细胞，终止处理后收获细胞。细胞吹散成单个细胞悬液，计数细胞吹散成单个细胞悬液

8、，计数。2,000rpm，4，离心离心5分钟收集细胞，按分钟收集细胞，按1106个个/ml的密的密度度 加入加入4预冷的预冷的PBS溶液重悬，充分混匀细胞后置于冰上溶液重悬，充分混匀细胞后置于冰上(最最 后后调整细胞浓度，与胶混合铺片后保证细胞是调整细胞浓度，与胶混合铺片后保证细胞是105个个/ml即可即可)。9操作步操作步骤骤(2)铺底层琼脂糖凝胶铺底层琼脂糖凝胶(操作操作)光面载玻片和盖玻片，按顺序标光面载玻片和盖玻片，按顺序标记记配制配制0.65%正常熔点琼脂糖，微波炉中加热正常熔点琼脂糖，微波炉中加热1min，摇匀，摇匀，重复重复23次使其完全融次使其完全融解解75水浴锅保水浴锅保温温

9、将干燥的载玻片缓慢浸入正常熔点凝胶中反复将干燥的载玻片缓慢浸入正常熔点凝胶中反复56次使得次使得凝凝 胶均匀分布在载玻片上，擦去载玻片背面残留的琼脂糖胶均匀分布在载玻片上，擦去载玻片背面残留的琼脂糖，37温箱干燥温箱干燥(一次性铺好一天要用的底层琼脂糖凝胶一次性铺好一天要用的底层琼脂糖凝胶)10操作步操作步骤骤(3)铺低熔点琼脂糖凝铺低熔点琼脂糖凝胶胶准备准备0.8%的低熔点琼脂糖凝胶，放置在的低熔点琼脂糖凝胶，放置在37水浴锅里待水浴锅里待用用吸取吸取30l的细胞悬液和的细胞悬液和270l的低熔点凝胶充分混的低熔点凝胶充分混匀匀在铺有在铺有0.65%的底层正常熔点凝胶的玻片上铺的底层正常熔点

10、凝胶的玻片上铺90l顶层顶层低低 熔点凝胶细胞混合液熔点凝胶细胞混合液(9000 cells)盖上盖玻片，过程中避免气泡产盖上盖玻片，过程中避免气泡产生生 冰上放置冰上放置20min后小心后小心移去盖玻移去盖玻片片11操作步操作步骤骤(4)细胞裂细胞裂解解铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，4水水 平放置，裂解平放置，裂解2 h。12(5)解解链链将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，4水平放置，水平放置，解解 链链0.5h。(6)电电泳泳接通电源，在接通电源，在300mA和和25V条件下电泳条件下电泳2

11、0min。(调节液面调节液面)操作步操作步骤骤(7)中中和和电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中和和20min。中和后用冰水洗。中和后用冰水洗2次次，2min/次次。(8)PI染染色色用浓度为用浓度为2g/ml的的PI染色液染色液4染色染色5min。染色结束，。染色结束，用用 预冷的预冷的PBS漂洗漂洗2min，弃，弃PBS，50%甘油保湿。甘油保湿。3h内阅内阅完完 玻片玻片。13操作步操作步骤骤(10)镜镜检检使用荧光正置显微镜观察玻片，仪器参数设置为使用荧光正置显微镜观察玻片，仪器参数设置为490nm激激 发光发光(蓝绿色，看见蓝绿

12、色，看见红色荧光红色荧光)、200倍观察倍观察、TIFF格式格式保保存存 文件。阅片时要文件。阅片时要保持玻片湿润保持玻片湿润，先低倍大体观察，再选，先低倍大体观察，再选择择 有代表性区域阅片有代表性区域阅片。14(11)单细胞凝胶电泳结果分单细胞凝胶电泳结果分析析每片随机观察每片随机观察100个细胞，计数彗星细胞百分率，用个细胞，计数彗星细胞百分率，用目镜目镜测测 微尺微尺测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析。统计学分析：采用统计学分析：采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组软件进行单因素方差分析，各组间间 两两比较采用两两比较采用q检验检验。实验记实验记录录彗

13、星细胞尾彗星细胞尾长长 范围范围(m)15彗星细胞百分彗星细胞百分率率(%)组组别别细胞细胞数数Cd 0M Cd 10M Cd 20M Cd40M表表1 不同剂量镉处理不同剂量镉处理LO2细胞中彗星细胞百分率和尾长比细胞中彗星细胞百分率和尾长比较较统计学分析统计学分析：SPSS软件，单因素方差分析，各组间两两比较采用软件，单因素方差分析，各组间两两比较采用q检验检验。测微尺介测微尺介绍绍目镜测微尺目镜测微尺：为一块圆形玻片，上面有刻度：为一块圆形玻片，上面有刻度；镜台测微尺镜台测微尺：一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆：一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈圈 内刻有分度，将长内刻有分度

14、，将长1mm的直线等分为的直线等分为100小格，每小格等小格，每小格等于于 0.01mm。16测微尺介测微尺介绍绍17测量步骤测量步骤：1、放置目镜测微、放置目镜测微尺尺2、放置镜台测微、放置镜台测微尺尺3、校正目镜测微、校正目镜测微尺尺4、卸下镜台测微、卸下镜台测微尺尺5、放上待测样本片，进行测量、放上待测样本片，进行测量(细胞核大小和尾长等细胞核大小和尾长等)测微尺介测微尺介绍绍移动台微尺并转动目微尺，使两个测微尺的左边第一条刻移动台微尺并转动目微尺，使两个测微尺的左边第一条刻度度 线完全重合，然后向右边找完全重合的刻度线。分别记录线完全重合，然后向右边找完全重合的刻度线。分别记录两两 重

15、合线间台微尺刻度数重合线间台微尺刻度数n和目微尺刻度数和目微尺刻度数m，并查处台微尺，并查处台微尺的的 实际刻度值实际刻度值a(一般为一般为0.01mm)。计算目微尺的实际刻度值计算目微尺的实际刻度值X(mm)X=na/m18本次操作步本次操作步骤骤19分分组组2人一张载玻片，每人一孔人一张载玻片，每人一孔(弃中间孔弃中间孔)20注意事注意事项项21铺低熔点凝胶时速度要快，防止凝结铺低熔点凝胶时速度要快，防止凝结；盖盖玻片时在火焰上过一下盖盖玻片时在火焰上过一下；细胞裂解、电泳时间均不应过长，以防脱胶细胞裂解、电泳时间均不应过长，以防脱胶；PI染色后清洗载玻片应轻柔且时间充足，以减少背景干扰染色后清洗载玻片应轻柔且时间充足，以减少背景干扰；荧光显微镜阅片时找到视野后应迅速拍照，以防荧光淬灭荧光显微镜阅片时找到视野后应迅速拍照，以防荧光淬灭。实验报实验报告告22请各位同请各位同学学 开始动手操开始动手操作作23