DNA遗传标记简介课件.ppt
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- DNA 遗传 标记 简介 课件
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1、DNA遗传标记简介遗传标记简介TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD研发部研发部韩典霖韩典霖Contents第一代第一代DNA遗传标记遗传标记1第二代第二代DNA遗传标记遗传标记2第三代第三代DNA遗传标记遗传标记33一、第一代一、第一代DNA遗传标记遗传标记-DNA指纹指纹克林顿与克林顿与DNADNA指纹指纹4 什么是什么是DNA指纹?指纹?年,年,JeffreysJeffreys用用“限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性”的方法分析的方法分析人基因组,检测到多条谱带,在人基因组,检测到多条谱带,在X X光胶片中呈一系列条纹,具光胶片中呈一系列条纹,具有高度的个体
2、特异性,犹如人的指纹,故称之为有高度的个体特异性,犹如人的指纹,故称之为“指纹指纹”技术技术。DNADNA指纹图谱,开创了检测指纹图谱,开创了检测DNADNA多态性(生物的不同个体或不同多态性(生物的不同个体或不同种群在种群在DNADNA结构上存在着差异)的多种多样的手段,如结构上存在着差异)的多种多样的手段,如RFLPRFLP(限制(限制性内切酶酶切片段长度多态性)分析、串联重复序列分析、性内切酶酶切片段长度多态性)分析、串联重复序列分析、RAPDRAPD(随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNA)分析等等。各种分析方法均以)分析等等。各种分析方法均以DNADNA的多态性的多态性为基础,产生
3、具有高度个体特异性的为基础,产生具有高度个体特异性的DNADNA指纹图谱,由于指纹图谱,由于DNADNA指纹指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性,且仍按简单的孟德尔方式遗图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性,且仍按简单的孟德尔方式遗传,成为第一代遗传标记。但该方法的不足之处是技术复杂,周期长传,成为第一代遗传标记。但该方法的不足之处是技术复杂,周期长,费用高;检测中需放射性物质,限制了广泛应用;检测多态性水平,费用高;检测中需放射性物质,限制了广泛应用;检测多态性水平过分依赖限制性内切酶,使多态性降低;过分依赖限制性内切酶,使多态性降低;DNADNA量大,分析速度慢。量大,分析速度慢。5131
4、3个个CODISCODIS基因座以及基因座以及AmelogeninAmelogenin在染色体上位置示意图在染色体上位置示意图二、第二代二、第二代DNA遗传标记遗传标记-STR6 在在9090年代初,包括复旦大学教授金力在内的科学家和年代初,包括复旦大学教授金力在内的科学家和FBIFBI合作,确定了合作,确定了1313个个STRSTR,并论证说这,并论证说这1313个个STRSTR在各种人在各种人群中,即使亲属关系的情况下,还是能很好的区分两个人。群中,即使亲属关系的情况下,还是能很好的区分两个人。美国联邦调查局(美国联邦调查局(FBIFBI)公布了)公布了1313个核心个核心STRSTR位点
5、(简称位点(简称CODISCODIS),经过群体调查,被证实在各类人群中具有高度),经过群体调查,被证实在各类人群中具有高度多态性,并经过多态性,并经过FBIFBI认证,目前已全面应用于各国法医学认证,目前已全面应用于各国法医学实验室,进行亲子鉴定和各类刑事案件的犯罪嫌疑人排除实验室,进行亲子鉴定和各类刑事案件的犯罪嫌疑人排除和认定,以及大的灾难性事故的个体认定(如:塌方、矿和认定,以及大的灾难性事故的个体认定(如:塌方、矿井爆炸、飞机失事等)。井爆炸、飞机失事等)。CODIS起源起源7 短串联重复序列短串联重复序列(short tandem repeats,STR)(short tandem
6、 repeats,STR)或称微卫星或称微卫星DNADNA重复重复序列序列(microsatellitemicrosatellite)是由长度为是由长度为3-73-7个碱基对的短串连重复序列组成个碱基对的短串连重复序列组成的。这些重复序列广泛存在于人类基因组的,平均的。这些重复序列广泛存在于人类基因组的,平均6-10kb6-10kb就出现一个,就出现一个,长度一般小于长度一般小于400bp400bp,且绝大多数位于非编码区。这些序列可以通过,且绝大多数位于非编码区。这些序列可以通过PCRPCR来检测,扩增区域内重复序列的重复次数不同导致来检测,扩增区域内重复序列的重复次数不同导致STRSTR位
7、点的等位点的等位基因分型差异,在电泳分离后,通过放射性同位素,银染和荧光检位基因分型差异,在电泳分离后,通过放射性同位素,银染和荧光检测可区别不同的基因型。测可区别不同的基因型。STRSTR具有分布广泛,信息量大,有高度多态性并遵循孟德尔共显性遗具有分布广泛,信息量大,有高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传等优点,目前已广泛应用于遗传制图、遗传连锁性分析、传等优点,目前已广泛应用于遗传制图、遗传连锁性分析、亲子鉴定、亲子鉴定、疾病基因定位和物种多态性研究、疾病基因定位和物种多态性研究、组织移植评价等诸多领域。与组织移植评价等诸多领域。与RFLPRFLP技术及技术及PCR-VNTRPCR-VNTR技
8、术相比,技术相比,STRSTR分型更适合微量、陈旧和降解分型更适合微量、陈旧和降解样本的检验。样本的检验。什么是什么是STR?8 每个每个STRSTR的等位基因数是根据能产生的等位基因数是根据能产生的重复次数来定的,比如的重复次数来定的,比如D3S1358D3S1358,四个碱基顺序的重复次数有四个碱基顺序的重复次数有8 8,9 9,1010,1111,1212,1313,1414,1515共共8 8种,其等种,其等位基因数就是位基因数就是8 8,这,这8 8个等位基因可以个等位基因可以产生产生3636种不同的基因型。假设可能的种不同的基因型。假设可能的基因数出现的概率是一样的话,比如基因数出
9、现的概率是一样的话,比如对对D3S1358D3S1358来说,有来说,有3636个基因型,那个基因型,那么某个特定的人有某种基因型(么某个特定的人有某种基因型(9 9,1515)的概率就是)的概率就是1/361/36。这样这。这样这1313个个STRSTR的不同基因型的产生某个特定的的不同基因型的产生某个特定的基因型组合就是随机概率是基因型组合就是随机概率是8.8x108.8x10(-(-22)22)。事实上,某个。事实上,某个STRSTR的不同基因型的不同基因型在人群中出现的概率是不同的;同样在人群中出现的概率是不同的;同样的基因型,在不同的人群中出现的概的基因型,在不同的人群中出现的概率也
10、会不同。所以,要先从人群中做率也会不同。所以,要先从人群中做样本调查,建立资料库,建立各种样本调查,建立资料库,建立各种STRSTR基因不同基因型在不同人群中的基因不同基因型在不同人群中的稳定概率,然后算出某个特定基因型稳定概率,然后算出某个特定基因型组合随机出现的可能概率。组合随机出现的可能概率。STR的特点的特点Alleles distinguishable by PCR product length9STR新技术新技术 MiniSTRMiniSTR技术是目前解决高度降解技术是目前解决高度降解DNADNA样本的样本的一个新的方向。通过重新设计引物,减少扩增产一个新的方向。通过重新设计引物,
11、减少扩增产物片段长度,使其结合在更靠近核心重复序列的物片段长度,使其结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列。理论上,侧翼序列。理论上,MiniSTRMiniSTR技术设计的引物越靠技术设计的引物越靠近核心重复序列,产生的近核心重复序列,产生的STRSTR等位基因片段长度就等位基因片段长度就越短,对于降解越短,对于降解DNADNA的的STRSTR分型成功率就越高。分型成功率就越高。10 STR商业应用商业应用 全球范围内的司法机构在办案过程中使用大量全球范围内的司法机构在办案过程中使用大量DNADNA个个体识别技术,我们通常称作体识别技术,我们通常称作“亲子鉴定亲子鉴定”就是一项具体应就是一项具体应
12、用。其中,经过美国用。其中,经过美国FBIFBI和欧洲认证,并广泛被接受的和欧洲认证,并广泛被接受的DNADNA个体识别检测试剂供应商有两家:分别为美国普洛个体识别检测试剂供应商有两家:分别为美国普洛麦格(麦格(PROMEGA CORPPROMEGA CORP)和美国应用生物系统公司(和美国应用生物系统公司(ABIABI)。目前在中国亲子鉴定市场额为)。目前在中国亲子鉴定市场额为8 8亿,全球市场近亿,全球市场近100100亿美金。由于近亿美金。由于近1010年来,中国大量进口这两家公司的年来,中国大量进口这两家公司的试剂盒和仪器设备(试剂盒和仪器设备(ABIABI是世界上最著名的是世界上最著
13、名的DNADNA测序仪和测序仪和PCRPCR生产商),为了打破这两家公司的技术垄断,国内公生产商),为了打破这两家公司的技术垄断,国内公司和研究单位也瞄准了这一特别市场。司和研究单位也瞄准了这一特别市场。11 20002000年年PromegaPromega公司在全球率先推出经公司在全球率先推出经FBIFBI认证的一次扩增认证的一次扩增1616个基因个基因座的座的DNADNA分型商品化试剂盒分型商品化试剂盒PowerPlex 16PowerPlex 16系统。系统。20092009年,经年,经FBIFBI批批准,升级版准,升级版PowerPlexPowerPlex 16 HS 16 HS系统可
14、被美国国家系统可被美国国家DNADNA索引系统(索引系统(NDISNDIS)的相关实验室所使用,这些实验室参与生成了)的相关实验室所使用,这些实验室参与生成了DNADNA图谱数据图谱数据。PowerPlex 16 HSPowerPlex 16 HS系统于系统于20092009年年3 3月上市,该试剂盒经过优化,可有月上市,该试剂盒经过优化,可有效提升疑难法医样品检测的成功率,简化建立罪犯数据库的工作流程效提升疑难法医样品检测的成功率,简化建立罪犯数据库的工作流程。这一新系统带有更强劲的反应缓冲液,以及热启动的。这一新系统带有更强劲的反应缓冲液,以及热启动的TaqTaq DNA DNA聚聚合酶,
15、这些特性很好地满足了上述技术需求。法医样品经常含有不利合酶,这些特性很好地满足了上述技术需求。法医样品经常含有不利于于DNADNA分型的抑制剂,该系统中经优化的反应缓冲液提高了对常规分型的抑制剂,该系统中经优化的反应缓冲液提高了对常规PCRPCR抑制剂的耐受性,即使是棘手的案件样品,也能得到良好的结果抑制剂的耐受性,即使是棘手的案件样品,也能得到良好的结果。试剂盒的性能亦得到了提高,能够对数据库样品进行直接分析,无。试剂盒的性能亦得到了提高,能够对数据库样品进行直接分析,无需需DNADNA纯化,这既能简化建立罪犯数据库的工作流程,又能最终提高纯化,这既能简化建立罪犯数据库的工作流程,又能最终提
16、高实验室的工作效率。实验室的工作效率。STR商业应用商业应用12 PromegaPromega PowerPlex 16 HS System PowerPlex 16 HS System PowerPlex 16 HSPowerPlex 16 HS系统可以进行系统可以进行1616个基因座个基因座(15(15个个STRSTR位点和位点和1 1个性别位点个性别位点)的复合扩增并用三色荧光进行检测的复合扩增并用三色荧光进行检测.在这些位点中在这些位点中D18S51,D21S11,D18S51,D21S11,TH01,D3S1358,TH01,D3S1358,PentaPenta E E用荧光素标记;
17、用荧光素标记;FGA,TPOX,D8S1179,FGA,TPOX,D8S1179,vWAvWA和和牙釉质蛋白基因用牙釉质蛋白基因用TMRTMR标记;标记;CSF1PO,D16S539,D7S820,D13S317,CSF1PO,D16S539,D7S820,D13S317,D5S818D5S818和和PentaPenta D D用用JOEJOE标记。标记。全部的全部的1616个位点在一管中同时扩增,然后通过单一进样或单一泳道进行个位点在一管中同时扩增,然后通过单一进样或单一泳道进行电泳分析。电泳分析。PowerPlexPowerPlex 16 HS 16 HS系统适用于系统适用于ABI PRI
18、SM 310ABI PRISM 310,31003100和和3100-3100-AvantAvant型型 遗传分析仪,遗传分析仪,Applied Applied BiosystemsBiosystems 3130 3130和和3130 xl3130 xl型遗传分析型遗传分析仪上进行电泳分析。仪上进行电泳分析。STR应用领域及商业价值应用领域及商业价值13 ABI ABI AmnFLSTRAmnFLSTR Identifier PCR Identifier PCRAmpFLSTRAmpFLSTR IdentifilerIdentifiler PCR PCR扩增试剂盒采用最新荧光技术(五色荧光,一
19、个泳道),实现扩增试剂盒采用最新荧光技术(五色荧光,一个泳道),实现了了1616个个STRSTR位点同时扩增同时检测。在这些位点中位点同时扩增同时检测。在这些位点中D18S51,D19S433,TPOXD18S51,D19S433,TPOX和和vWAvWA用用NEDNED染料标记;染料标记;AmelogeninAmelogenin,D5S818,D5S818和和FGAFGA用用PETPET染料标记;染料标记;D2S1338,D3S1358,D2S1338,D3S1358,D13S317,D16S539D13S317,D16S539和和TH01TH01用用VICVIC染料标记;染料标记;CSF1
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