Alport综合征：从基础到临床课件.ppt

1、Alport综合征：从基础到临床综合征：从基础到临床Alport综合征综合征遗传性肾脏疾病遗传性肾脏疾病临床表现临床表现:血尿、感音神经性耳聋、听力减退、血尿、感音神经性耳聋、听力减退、眼部异常眼部异常进行性肾功能衰竭进行性肾功能衰竭预后差预后差大多数为大多数为 X连锁显性遗传连锁显性遗传（XLAS），由编码，由编码IV型胶原型胶原5 链的链的COL4A5基因突变所致基因突变所致主要问题主要问题 诊断诊断 花费少花费少 更有效更有效 创伤小创伤小分子生物学发病机制分子生物学发病机制Alport综合征综合征Alport综合征综合征:从基础到临床从基础到临床诊断诊断通过皮肤穿刺进行临床诊断通过皮肤

2、穿刺进行临床诊断通过通过mRNA分析进行基因诊断分析进行基因诊断机制机制 COL4A5基因突变后基因突变后mRNA的表达量的表达量IV型胶原型胶原 5 链甘氨酸替代的影响链甘氨酸替代的影响Alport综合征综合征:从基础到临床从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过皮肤穿刺进行临床诊断通过通过mRNA分析进行基因诊断分析进行基因诊断COL4A5基因突变后基因突变后mRNA的表达量的表达量IV型胶原型胶原 5链甘氨酸替代的影响链甘氨酸替代的影响Alport综合征综合征:从基础到临床从基础到临床通过皮肤穿刺检测进行临床诊断通过皮肤穿刺检测进行临床诊断通过通过mRNA分析进行基因诊断分析进行基因诊断

3、COL4A5基因突变后基因突变后mRNA的表达量的表达量 IV胶原胶原 5链甘氨酸替代的影响链甘氨酸替代的影响临床诊断临床诊断肾穿肾穿电镜电镜-“-“金标准金标准”GBM:增厚、变薄以及致密层的分裂增厚、变薄以及致密层的分裂年龄太小的患儿不能耐受年龄太小的患儿不能耐受既使在电镜下既使在电镜下GBM也有不典型变化也有不典型变化:薄基底膜病的变化薄基底膜病的变化(年龄偏小的儿童和女性年龄偏小的儿童和女性)缺陷缺陷皮穿皮穿n 方便方便n 创伤小创伤小n 3 3 1 1mm皮肤穿刺和皮肤穿刺和 5(IV)链染色链染色诊断方法诊断方法免疫荧光免疫荧光抗抗-5(IV)链单克隆抗体链单克隆抗体正常正常:阳性

4、阳性XLAS男性：男性：阴性阴性XLAS女性女性:间断阳性间断阳性丁洁，等：中华儿科杂志，丁洁，等：中华儿科杂志，35:177,1997 Ding Jie,et al:Chin Med J,110:584,1997Alport综合征的临床诊断综合征的临床诊断皮肤穿刺皮肤穿刺 抗抗IV胶原胶原 5链的单克隆抗体链的单克隆抗体免疫荧光染色免疫荧光染色 皮肤基底膜皮肤基底膜(EBM)阴性阴性:男性男性XLAS 间断阳性间断阳性:女性女性XLAS 连续阳性连续阳性:正常人正常人 个别个别XLAS 常染色体隐性患者常染色体隐性患者（ARAS）EBM荧光染色荧光染色 正常人正常人XLAS男性男性XLAS女

5、性女性ARAS 1（IV）5（IV）肾穿组织荧光染色肾穿组织荧光染色 正常人正常人XLAS男性男性 ARAS 1（IV）3（IV）4（IV）5（IV）皮肤穿刺皮肤穿刺 -IV型胶原型胶原 5链免疫荧光染色链免疫荧光染色诊断诊断:89家系家系,199患者患者诊断率诊断率:96%Chin J Pediatr 1997;Pediatr Nephrol 2002Alport综合征的临床诊断综合征的临床诊断 证实证实COL4A5 基因突变基因突变:917GA 镜下血尿镜下血尿 偶有蛋白尿偶有蛋白尿 Chin J Practic Pediatr 2003大多数大多数:van der环环,36%(5/14)

6、Kidney Int 1999 2(4%):EBM 5(IV)正常正常皮肤穿刺皮肤穿刺 -IV型胶原型胶原 5链免疫荧光染色链免疫荧光染色 年龄最小的年龄最小的1例例:1岁岁 第第1例例:常染色体隐性常染色体隐性 Chin J Pediatr 1999 血尿血尿2 2年年 无家族史无家族史 父母非近亲婚配父母非近亲婚配 199例例AS中中2例为例为ARASAlport综合征临床诊断综合征临床诊断Alport综合征综合征:从基础到临床从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过皮肤穿刺进行临床诊断通过通过mRNA分析进行基因诊断分析进行基因诊断COL4A5基因突变后基因突变后mRNA的表达量的表达量

7、IV型胶原型胶原 5链甘氨酸替代的影响链甘氨酸替代的影响Alport综合征综合征:从基础到临床从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过皮肤穿刺进行临床诊断通过通过mRNA分析进行基因诊断分析进行基因诊断COL4A5基因突变后基因突变后mRNA的表达量的表达量IV型胶原型胶原 5链甘氨酸替代的影响链甘氨酸替代的影响基因诊断基因诊断明确的遗传性疾病明确的遗传性疾病遗传方式遗传方式:X:X连销显性遗传、常染色体隐性遗传和连销显性遗传、常染色体隐性遗传和常染色体显性遗传常染色体显性遗传基因诊断基因诊断 遗传咨询遗传咨询 产前诊断产前诊断 了解发病机制了解发病机制基因诊断基因诊断基因组基因组DNA分析分

8、析:PCR-SSCP:检测率检测率 5079%Hum Mutat 1999;Am J Kidney Dis 2001PCR-直接测序直接测序:检测率检测率85%J Am Soc Nephrol 1998 COL4A5 基因大小基因大小:250kb 基因结构基因结构:51外显子外显子 无无“热点突变热点突变”花费高花费高(51外显子外显子)已报道的检测率不高已报道的检测率不高(不超过不超过85%)2/3免疫荧光免疫荧光1/3皮肤成纤维皮肤成纤维细胞培养细胞培养RNA提取提取新技术新技术-5(IV)链链mRNA分析分析RT-PCR 5个相互重叠个相互重叠的片段的片段皮肤穿刺皮肤穿刺方便方便创伤小创

9、伤小3 1mm RT-PCR 电泳电泳:大的缺失大的缺失/插入插入直接测序直接测序:小的小的/点突变点突变 通过基因组通过基因组DNA证实证实新技术新技术:5(IV)链链mRNA分析分析检测率检测率:90.3%3/28(10.7%)小的插入或缺失小的插入或缺失 12/28(42.8%)错义突变错义突变2/28(7.1%)无义突变无义突变4/28(14.4%)单体型单体型7/28(25.0%)剪切突变剪切突变 基因诊断基因诊断 4/28(14.3%)典型的剪切位点典型的剪切位点 3/28(10.7%)不典型或隐藏的剪切位点不典型或隐藏的剪切位点Kidney Inter,67(4):1268-12

10、74,2005 不典型或隐藏的剪切位点不典型或隐藏的剪切位点:10%g.668-12G A-skipping E9 g.1036+5G T-skipping E14 g.1625+56_1625+57insC-partially skipping E21基因诊断基因诊断被忽视或被认为是基因组被忽视或被认为是基因组DNA内含内含子的多态性子的多态性基因诊断基因诊断通过通过 5(IV)链链mRNA分析检测分析检测COL4A5基因突变基因突变 简单、创伤小简单、创伤小 (1个皮肤样本个皮肤样本)hair-root(鉴定鉴定24个突变个突变)Hum Genet 2002 更经济更经济 (费用仅为基因组

11、费用仅为基因组DNA分析的分析的1/61/7)基因诊断基因诊断通过通过 5(IV)链链mRNA分析检测分析检测COL4A5基因突变基因突变:可信、一致可信、一致每一个突变均在每一个突变均在DNA水平进一步得到证实水平进一步得到证实 Kidney Inter,67(4):1268-1274,2005 成纤维细胞没有可变剪切体成纤维细胞没有可变剪切体其他组织其他组织 肾脏肾脏:有有41A和和41B外显子外显子 Kidney Int 1993 白细胞白细胞:无无41A和和41B外显子外显子 Pediatr Nephrol 2001 90.3%(28/31)XLAS患者突变检测患者突变检测 19 新突

12、变新突变Chin J Pediatr 1999;Pediatr Nephrol 2002;Chin J Nephrol 2003 基因诊断基因诊断 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 COL4A5 基因基因53Alport综合征综合征:从基础到临床从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过皮肤穿刺进行临床诊断通过通过mRNA分析进行基因诊断分析进行

13、基因诊断COL4A5基因突变后基因突变后mRNA的表达量的表达量IV型胶原型胶原 5链甘氨酸替代的影响链甘氨酸替代的影响Alport综合征综合征:从基础到临床从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过皮肤穿刺进行临床诊断通过通过mRNA分析进行基因诊断分析进行基因诊断COL4A5基因突变后基因突变后mRNA的表达量的表达量IV型胶原型胶原 5链甘氨酸替代的影响链甘氨酸替代的影响突变突变mRNA的表达量的表达量XLAS女性患者临床表现不一女性患者临床表现不一 大多数女性大多数女性:镜下血尿镜下血尿 无或轻微蛋白尿无或轻微蛋白尿 肾功能正常肾功能正常8-15%肾功能衰竭（肾功能衰竭（CRF）NDT

14、1990;Am J Kidney Dis 200140岁出现终末期肾衰（岁出现终末期肾衰（ESRD）:大约大约12%60岁出现终末期肾衰岁出现终末期肾衰:大约大约30-40%J Am Soc Nephrol 2000日本报道日本报道:EBM中中 5(IV)表达阴性率和疾病的程度表达阴性率和疾病的程度相关相关 J Am Soc Nephrol 1998突变突变mRNA的表达量的表达量XLAS 女性患者临床表现不一女性患者临床表现不一 家族之间肾脏疾病的严重程度明显不同家族之间肾脏疾病的严重程度明显不同推测推测X染色体随机或非随机失活所致染色体随机或非随机失活所致?突变突变mRNA的表达量的表达量

15、X连锁女性临床资料连锁女性临床资料 PatentGross hematuriaMicroscopic hematuriaDegree of proteinuria R e n a l insufficiencyEBM 5(IV)stainingLL Yes +No MosaicLY No +No MosaicSL No +-+No MosaicWS Yes +-No MosaicZF No +Yes MosaicZY No +No Mosaic 方法方法成纤维细胞培养成纤维细胞培养RNA提取提取RT-PCRPAGE光密度比值分析光密度比值分析突变突变mRNA的表达量的表达量Normal ban

16、d Mutant band突变突变mRNA的表达量的表达量PatientTimes of PCRRange of OD of normal fragmentRange of OD of abnormal fragmentRatio of mutant mRNA/total mRNALL8637010556,even no normal fragment38907544500.85LY8no normal fragment4715309401SL861742410211505290,even no abnormal fragment0.19WS4150002945811925208000.42Z

17、F44601175956118352130.67ZY420952453565520227700.25光密度比值分析光密度比值分析 突变突变mRNA的表达量的表达量00.511.522.533.500.20.40.60.811.2the ratio of mRNA expression of mutant/totalCOL4A5the degree of proteinuriathe degree of proteinuria蛋白尿和蛋白尿和mRNA表达量的关系表达量的关系突变突变mRNA的表达量的表达量结论结论:突变突变COL4A5 基因的基因的mRNA表达量和表达量和 XLAS 女性患者的表

18、型相关女性患者的表型相关 XLAS女性患者突变女性患者突变COL4A5 基因的基因的mRNA表达量多者表型更严重表达量多者表型更严重Alport综合征综合征:从基础到临床从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过皮肤穿刺进行临床诊断通过通过mRNA分析进行基因诊断分析进行基因诊断COL4A5基因突变后基因突变后mRNA的表达量的表达量IV型胶原型胶原 5链甘氨酸替代的影响链甘氨酸替代的影响Alport综合征综合征:从基础到临床从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过皮肤穿刺进行临床诊断通过通过mRNA分析进行基因诊断分析进行基因诊断COL4A5基因突变后基因突变后mRNA的表达量的表达量IV型胶

19、原型胶原 5链甘氨酸替代的影响链甘氨酸替代的影响甘氨酸替代甘氨酸替代 发病机制假说发病机制假说:突变的突变的COL45A基因编码异常的基因编码异常的 5(IV)链链:易降解易降解 不能和其他的不能和其他的(IV)链形成复杂的网状结构链形成复杂的网状结构Medicine 1999 进一步的实验发现进一步的实验发现:突变突变 5(IV)连几乎不能和其他连几乎不能和其他(IV)链形成三链形成三螺旋结构螺旋结构 或者或者:形成的三螺旋结构中含有突变的形成的三螺旋结构中含有突变的 5(IV)链链:很少一部分很少一部分 Kidney Int 2003甘氨酸替代甘氨酸替代3355NC1NC11430 aa1

20、430 aa 5(IV)链中链中2530%的甘氨酸的甘氨酸 大约大约3040%突变涉及甘氨酸残基的替代突变涉及甘氨酸残基的替代 J Am Soc Nephrol 2000NH2229 aa229 aa（interrupted Glyinterrupted Gly-X-Y repeats-X-Y repeats）COOHNC1甘氨酸替代甘氨酸替代同一位点的甘氨酸被不同氨基酸替代同一位点的甘氨酸被不同氨基酸替代 不同位点的甘氨酸被同一氨基酸替代不同位点的甘氨酸被同一氨基酸替代 青少年型青少年型 AS 成人型成人型 AS甘氨酸替代甘氨酸替代两例甘氨酸替代患者两例甘氨酸替代患者Glycine-Seri

21、neGlycine -Valine 方法方法质粒构建质粒构建 pET-28a蛋白表达蛋白表达 E.Coli蛋白鉴定蛋白鉴定 immunoblot +mass spectrometry 圆二色普检测圆二色普检测 甘氨酸替代甘氨酸替代 甘氨酸替代甘氨酸替代Blue:normal圆二色普检测圆二色普检测green-G1030S (Adult-type)black-G1015V (Juvenile-type)甘氨酸替代甘氨酸替代 重组蛋白的二级结构组成重组蛋白的二级结构组成（%）研究对象研究对象-螺旋螺旋 -折叠折叠 转角转角 无规卷曲无规卷曲 对照对照 0.0 46.0 13.5 40.5 患者患者1 12.9 38.1 24.6 24.4 患者患者2 0.0 30.8 19.0 50.2结论结论:两种甘氨酸替代两种甘氨酸替代 5(IV)链的二级结构明显不同链的二级结构明显不同5(IV)二级结构的改变能解释二级结构的改变能解释AS表型的多样性表型的多样性.不同位点的甘氨酸也许对二级结构起不同的作用不同位点的甘氨酸也许对二级结构起不同的作用.BBRC,2004,316(4):1143-1149小小 结结皮肤穿刺皮肤穿刺 临床诊断临床诊断 从从mRNA技术平台进行基因诊断技术平台进行基因诊断分子机制分子机制 突变突变mRNA的表达量的表达量 甘氨酸替代甘氨酸替代