HPLC方法建立和优化课件.ppt

1、HPLC方法的建立和优化方法的建立和优化 绪论绪论 目目录录 分离的基础分离的基础 2 色谱柱色谱柱3 样品分离的系统方法样品分离的系统方法4 梯度洗脱梯度洗脱 51 定性和定量分析定性和定量分析 目目录录6 方法的完善方法的完善 7 绪 论色谱仪器介绍色谱仪器介绍色谱仪器：色谱仪器：控制器控制器输液泵输液泵储液瓶储液瓶溶剂组织器溶剂组织器进样器进样器色谱柱（柱温箱）色谱柱（柱温箱）检测器检测器色谱仪器介绍色谱仪器介绍原理图：原理图：输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器色谱工作站色谱工作站储液瓶储液瓶HPLCHPLC方法建立的步骤方法建立的步骤HPLCHPLC方法建立的步骤方法建立

2、的步骤HPLCHPLC方法建立的步骤方法建立的步骤样品的性质，确定分离目的样品的性质，确定分离目的v 了解样品的相关情况：了解样品的相关情况：o所含化合物的数目；o化学结构（官能团）；o分子量；opKa值；oUV光谱图；o被测组分在样品中的浓度范围；o样品的溶解度、沸点及其稳定性；o可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。o要分离的化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物1.1 1.1 样品具有什么样的性质？样品具有什么样的性质？v 定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱鉴定？谱鉴定？v 是否分析所有组分？定性？一种条

3、件有困难？分组分析？是否分析所有组分？定性？一种条件有困难？分组分析？v 定量分析的准确度和精密度？（主成分精密度在定量分析的准确度和精密度？（主成分精密度在12）v 不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留、环境样品等）留、环境样品等）v 分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选择。分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选择。v 实验室的条件，如实验室的条件，如HPLC仪器的配置和档次；色谱柱系统；仪器的配置和档次；色谱柱系统；是否有恒温？是否可以做梯度？分析成本？实验室人员的是否有恒温？是否可以做梯度？分析成本？

4、实验室人员的操作技能如何？方法是否具有可移植？等等。操作技能如何？方法是否具有可移植？等等。1.2 1.2 明确分析目的明确分析目的v 可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）v 需稀释、需稀释、pH缓冲、加内标或其它操作缓冲、加内标或其它操作v 固体样品选择合适的溶剂溶解后进样固体样品选择合适的溶剂溶解后进样v 需提取分离的样品需提取分离的样品v 预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。总之，将样品溶于合适的溶剂；或者用合适的溶液提总之，将样品溶于合适的溶剂；或者用合适的溶液提取出来、或者分离处理

5、对测定有干扰的物质，在处理中应取出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意被测组分的稳定性和提取率注意被测组分的稳定性和提取率1.3 1.3 样品的预处理与检测样品的预处理与检测v 按照样品的特性分为以下二类：按照样品的特性分为以下二类：nA 一般样品（分子量2000）可采用基本标准的方法。（中性的、离子的）反相、离子对、非水反相、正相、离子交换nB 特殊样品n 无机离子：离子色谱n异构体：手性分析n对映体、n生物样品：肽类、核苷酸n大分子：蛋白质、核酸、糖类，合成聚合物。需要大孔径色谱柱填料（10nm孔径）等等 1.4 HPLC1.4 HPLC方法建立方法建立1.5 HPLC1.5

6、 HPLC首选方法建立首选方法建立方法方法/特点特点/色谱柱色谱柱适用范围适用范围反相HPLC 流动相：水有机溶剂能溶于水有机溶剂的大部分样品，中性或非离子化合物 色谱柱：C18、C8、苯基、三甲基硅烷 （TMS）、氰基离子对HPLC 流动相：缓冲液（加离子对试剂）有机溶剂离子或可电离化合物，尤其是碱或阳离子样品 色谱柱：C18、C8、氰基正相HPLC 流动相：有机溶剂混合液不溶于水有机溶剂的亲脂样品，异构体等样品 色谱柱：氨基、硅胶、氰基、二醇基方法特性：方法特性：1.5 HPLC1.5 HPLC首选方法建立首选方法建立分离条件分离条件较好的首要选择较好的首要选择色谱柱 尺寸（长度，ID）1

7、504.6mm 粒度5m 固定相C18流动相 溶剂A和B缓冲液乙腈%B80100%缓冲液（化合物、pH、浓度）25mM磷酸钾，2.0pH 1.5样品保留值0.5k20分离时间小于510min较为理想定量一般：2%(RSD)要求不高：5%(RSD)痕量：15%(RSD)压力2000Psi（新柱）2000(理论踏板数）溶剂消耗越少越好目标：目标：1.6 HPLC1.6 HPLC方法优化方法优化v 合理缩短分析时间、提高灵敏度、分离度，成本优化，方合理缩短分析时间、提高灵敏度、分离度，成本优化，方法的稳定性。法的稳定性。v 对出现的各种色谱现象，包括仪器和样品的稳定性等提出对出现的各种色谱现象，包括

8、仪器和样品的稳定性等提出切实可行的办法。切实可行的办法。v 建立合理的数据处理方法等。建立合理的数据处理方法等。1.6 1.6 方法的优化方法的优化1.7 1.7 完善完善HPLCHPLC方法方法v 定性与定量方法的建立及论证。定性与定量方法的建立及论证。v 对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立可样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定的分析方法。靠的稳定的分析方法。v 解决出现的问题解决出现的问题v 方法的可移植性方法的可移植性 1.7 1.7 完善完善HPLCH

9、PLC方法方法1.7 1.7 完善完善HPLCHPLC方法方法问题问题1、柱效低2、色谱柱寿命短3、保留值变化4、定量精度差5、出现干扰峰6、峰严重拖尾或前趋7、分离度不够，峰不能完全分开经常出现的问题：经常出现的问题：二、色谱柱基础知识二、色谱柱基础知识（一）（一）2.1 2.1 色谱柱的性能指标色谱柱的性能指标1 1、柱效率柱效率:N实际工作中一般取1/2峰高处计算柱效（保留时间）：N=5.54（tR/t1/2）2基本理论踏板数计算公式：基本理论踏板数计算公式：N VR/W2WMethod Wtan16切线法W1/2h5.54半峰高 W393w4164w5255VRtRvR50%32.4%

10、13.4%4.4%WW3W1/2hW5W4tR2.1 2.1 色谱柱的性能指标色谱柱的性能指标1 1、柱效率柱效率:NW5W4W5W4从图上可以看出，如果峰拖尾，采用N1/2h和N4的方法测柱效时，拖尾的影响反应不出来，而如果采用N5时，2号图的柱效就可以反应出来W1/2hW1/2h122.1 2.1 色谱柱的性能指标色谱柱的性能指标2 2、死体积死体积V V0 0/保留体积保留体积VR/相对保留体积相对保留体积VR 死时间死时间t t0 0/保留时间保留时间tR/相对保留时间相对保留时间tR :VRvRtRVRtRt0v0V0:包括色谱柱死体积、管路以及接口的死体积。死体积的大小体现了色谱柱

11、和仪器系统的好坏。2.1 2.1 色谱柱的性能指标色谱柱的性能指标2 2、保留因子、保留因子k:VRvRtRVRtRt0v0k:用来描述色谱柱中溶质的迁移速度kVR/V02.1 2.1 色谱柱的性能指标色谱柱的性能指标3 3、分离因子（、分离因子（a a）:VRvRtRVRtRt0v0a a:用来描述和表征两种不同的溶质在色谱柱里的分离过程a a k2/k12.1 2.1 色谱柱的性能指标色谱柱的性能指标4 4、峰的对称性（、峰的对称性（A AS）:AS:用来描述和表征两种不同的溶质在色谱柱里的分离过程As：0.951.3（一般）1.5好好不好不好很差很差干净样品：溶液均质，其成分在每次进样之

12、间都能完全流出色谱柱2.2 2.2 色谱柱常见问题色谱柱常见问题1 1、保留值与分离度重复性不好、保留值与分离度重复性不好结果结果原原 因因主主 要要 变变 化化柱间差异基体、键合的不同k 、a使用期间柱变化柱床扰乱N键合相丢失k 、a硅胶基体溶解k 、a非流出物质堆积堵塞k 、a柱外效应进样量大N死体积N分离控制不好流动相组分改变k 、a流速改变N、a温度改变k 、a、N柱平衡慢再平衡时间不足k 、a柱超载样品质量过大k 、N2.2 2.2 色谱柱常见问题色谱柱常见问题2.2 2.2 色谱柱常见问题色谱柱常见问题2 2、峰不对称：、峰不对称：导致分离的质量和精密度下降 金属杂质如铁和铝等，会

13、导致硅胶表面活性增加，使碱性化合物和螯合物的色谱峰严重拖尾。2.2 2.2 色谱柱常见问题色谱柱常见问题2 2、峰拖尾解决方法、峰拖尾解决方法2.2 2.2 色谱柱常见问题色谱柱常见问题3 3、色谱柱寿命、色谱柱寿命2.2 2.2 色谱柱常见问题色谱柱常见问题3 3、色谱柱寿命、色谱柱寿命 低pH流动相中寿命缩短的主要原因是键合相在酸性条件下水解，这会导致保留时间和峰形的明显改变2.2 2.2 色谱柱常见问题色谱柱常见问题3 3、色谱柱的维护、色谱柱的维护三、色谱分离基础三、色谱分离基础 3.1 3.1 溶剂的基础知识溶剂的基础知识AcetoneTHFMeOHMeCNEtOHMeOH溶剂粘度溶

14、剂粘度：3.1 3.1 溶剂的基础知识溶剂的基础知识溶剂强度溶剂强度：水乙醇甲醇正己烷异丙醇二氯甲烷四氰呋喃乙酸乙脂非极性非极性极性极性乙腈 3.2 3.2 液相色谱的分离度液相色谱的分离度分离度分离度R Rs s：色谱的根本目的是将混合物分离成单一的化合物！色谱的根本目的是将混合物分离成单一的化合物！v 评价一个评价一个HPLCHPLC方法的标准之一：分离度。方法的标准之一：分离度。v 下面两个图哪个分离更好些？下面两个图哪个分离更好些？3.3 3.3 液相色谱的分离度液相色谱的分离度 3.4 3.4 不同的分离度不同的分离度v 分离度的方程分离度的方程 n k 是保留因子，表达了样品与柱填

15、料的作用强弱。K=(tR-t0)/t0;n a 是分离因子（选择性），描述两化合物分离的好坏程度。是化学因素。受流动相和固定相影响。a=k2 /k1;n N 是理论塔板数（柱效），描述色谱峰的谱带展宽程度。受柱长短和颗粒度大小以及流速影响。3.5 3.5 影响分离的因素影响分离的因素K、a a、N N 初始初始改变改变k增加增加a增加增加N K K、a a、N N 对分离度的影响对分离度的影响v 改变改变k值的方法值的方法 n调节流动相的溶剂强度npH、离子强度、温度等（温度每升高1度，k减少12）n梯度淋洗改变改变K K、a a、N N 的途径的途径HPLC方法方法手段手段结果结果反相有机溶

16、剂比例增加K变小改为溶剂强度更强的溶剂K变小增加温度K变小正相极性有机溶剂增加K变小离子对与反相相反离子交换离子强度增加K变小v 改变改变a a的途径的途径n 改变流动相改变流动相n 改变温度n 改变样品的本身性质n 改变固定相改变改变K K、a a、N N 的途径的途径条件（流动相）条件（流动相）结果结果改变B%（所有）a改变改变有机溶剂（所有）a改变混合有机溶剂（所有）a改变改变PH（离子）a改变改变离子对试剂浓度（离子）a改变改变缓冲液或缓冲液浓度（离子）a改变改变添加剂浓度（离子）a改变加络合试剂（可络合时）a改变v 改变改变a a的途径的途径n 改变流动相改变流动相改变改变K K、a

17、 a、N N 的途径的途径v 改变改变N值的方法值的方法 n减小填料的颗粒度n找到最佳的流速（根据不同内径）n合适的温度：粘度低、温度高n降低溶剂的粘度n增加柱长n减小柱外效应改变改变K K、a a、N N 的途径的途径v 改变改变N值的方法值的方法 n减小填料的颗粒度n找到最佳的流速（根据不同内径）n合适的温度n降低溶剂的粘度n增加柱长改变改变K K、a a、N N 的途径的途径范德米特范德米特(van Deemeter)(van Deemeter)曲线曲线v 体积超载：体积超载：v 质量超载（高浓度）质量超载（高浓度）进样量的影响进样量的影响四、液相色谱的分离机四、液相色谱的分离机理理4.

18、1 4.1 液相色谱的分离机理液相色谱的分离机理4.1.1 4.1.1 吸附色谱吸附色谱4.1.2 4.1.2 分配色谱分配色谱4.1.3 4.1.3 离子色谱离子色谱4.1.4 4.1.4 体积排阻色谱体积排阻色谱4.1.5 4.1.5 亲和色谱亲和色谱色谱柱（二）色谱柱（二）色谱柱色谱柱 4.1 色谱柱填料色谱柱填料3.2色谱柱与塔板数的关系色谱柱与塔板数的关系v 色谱柱的塔板数越高，柱效越高，分离效果越好。色谱柱的塔板数越高，柱效越高，分离效果越好。v 理论塔板数的计算：理论塔板数的计算：v v 3.3好色谱柱应具备的性能好色谱柱应具备的性能v 好的峰形好的峰形 尤其尤其对对于于碱碱性化

19、合物性化合物,可以不加可以不加额额外的流外的流动动相添加相添加剂剂 减减小拖尾因子以提高分离度和定量准确性小拖尾因子以提高分离度和定量准确性v 高的柱效高的柱效 1.8um,3.5um和和5um，不同的粒，不同的粒径径可以可以满满足任何分离的柱效要求足任何分离的柱效要求 柱效柱效N 采用柱效采用柱效进进一步一步优优化分离度化分离度v 好的好的选择选择性性 C18是最受是最受欢欢迎的迎的键键合相，且适用于大部分化合物的分离合相，且适用于大部分化合物的分离v 在在较宽较宽的流的流动动相范相范围内围内均可使用均可使用 简简化方法化方法开发开发；适于更多的适于更多的应应用用v 出色的重出色的重现现性性

20、 不同批次的色不同批次的色谱谱柱都有很好的重柱都有很好的重现现性性v 好的使用好的使用寿寿命命 至少能分析至少能分析1000 个样个样品品 3.4保证柱寿命和性能良好保证柱寿命和性能良好1.1.针对不同的样品选择合适的填充柱针对不同的样品选择合适的填充柱2.2.减小压力波动，避免猛烈撞击减小压力波动，避免猛烈撞击3.3.溶剂和样品严格过滤，使用保护柱和在线过滤片。溶剂和样品严格过滤，使用保护柱和在线过滤片。4.4.间断性地用强溶剂冲洗柱子：正相用氯仿间断性地用强溶剂冲洗柱子：正相用氯仿/异丙醇异丙醇1 1：1 1；反相用甲醇反相用甲醇5.5.复杂样品进行前处理，尽量减少无谓的强滞留成份和微粒复

21、杂样品进行前处理，尽量减少无谓的强滞留成份和微粒6.6.不要超过柱子使用的不要超过柱子使用的PHPH值范围，一般值范围，一般2-72-7，防止键合相流失，防止键合相流失7.7.不用的柱子要冲洗掉里面的缓冲液，用乙睛保存，避免高浓不用的柱子要冲洗掉里面的缓冲液，用乙睛保存，避免高浓度的水和醇类。度的水和醇类。3.5色谱柱问题及解决办法色谱柱问题及解决办法v 保留保留值与值与分离的重分离的重现现性性v 1.1.选择选择色色谱谱柱柱时时，应应考考虑虑其化其化学学性性质质v 2.2.在流在流动动相中用相中用缓缓冲冲剂剂，以除去化，以除去化学学的或硅的或硅羟羟基效基效应应，尽尽量量减减少少谱谱峰拖尾。峰

22、拖尾。v 3.3.保保证温证温度，流速，度，流速，压压力和溶力和溶剂剂成分的恒定。成分的恒定。v 4.4.流流动动相上机要相上机要脱气脱气v 5.5.保保证证上上样样不超不超载载v 谱谱峰拖尾峰拖尾v 柱外效柱外效应应4.样品分离的系统方法样品分离的系统方法v充分用已知样品结构确定以哪种方法开始充分用已知样品结构确定以哪种方法开始n普通反相?离子抑制?离子对?还是其他v观察流动相条件改变时色谱峰的移动观察流动相条件改变时色谱峰的移动n根据变化的方向及大小决定下一步干什么v改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！v色谱柱的改变影响最大色谱柱的改变影响最

23、大4.1 分离前的准备分离前的准备v 想办法得到各种信息想办法得到各种信息n向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法n查文献，如CA(化学文摘)n仪器制造商的文献，如Watersv 对色谱柱有足够的了解对色谱柱有足够的了解n掌握分离机理，自己开发方法v 充分了解您自己的样品充分了解您自己的样品4.2 首先要了解的内容首先要了解的内容v 分析前要知道：分析前要知道：灵敏度的要求有多高灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析有多少组份要分析?对分析的精确度、准确度等有多高要求对分析的精确度、准确度等有多高要求?是否因是日常检验，而要求方法容易使用是

24、否因是日常检验，而要求方法容易使用?v 分离的目的和要求：分离的目的和要求：要分离（即制备）的样品量有多大要分离（即制备）的样品量有多大?要分离的组份在样品中的含量很高要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量还是微量?是否需要保持生物活性是否需要保持生物活性?对分离产物纯度的要求有多高对分离产物纯度的要求有多高?纯度或活性的鉴定如何完成纯度或活性的鉴定如何完成?灵敏度的要求有多高灵敏度的要求有多高?4.3 一般的具体步骤一般的具体步骤v 先用一根短的色谱柱先用一根短的色谱柱v 用相对较高的流速用相对较高的流速v 使用尽可能纯度高的标准品使用尽可能纯度高的标准品v 先用高强度的洗脱液先用高强度的

25、洗脱液v 调节调节k 值改变保留值值改变保留值v 调节调节a a值改变选择性值改变选择性v 调节柱长度改变柱效及分离速度调节柱长度改变柱效及分离速度请请记记住住 每每次次改改变变一一个个参参数数4.4 尽量采用文献方法尽量采用文献方法v 色谱柱填料的种类、品牌是否相同色谱柱填料的种类、品牌是否相同?v 注意文献方法的流动相注意文献方法的流动相n是否损害色谱柱?n如色谱填料品牌不同，需要调整流动相v 注意色谱柱的规格：内径、柱长注意色谱柱的规格：内径、柱长n需要调整流速、进样量v 注意梯度条件注意梯度条件v 了解系统的滞后体积（梯度）了解系统的滞后体积（梯度）4.5 反相色谱的方法开发反相色谱的

26、方法开发v 开发过程实例开发过程实例n色谱条件n色谱柱：C18，4mm30mmn流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱n流速：2ml/minn样品：对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben)对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben)对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)反相色谱条件的改变反相色谱条件的改变v 改变容量因子改变容量因子 Kv 改变色谱柱改变色谱柱v 改变选择性改变选择性a a：通过改变流动相改变选择性通过改变流动相改变选择性4.6离子型化合物的分离方式离子型化合物的分离方式v使用离子交换柱使用离子交换柱 离子交换法离子交

27、换法n主要用于“强”阴、阳离子v使用反相柱使用反相柱n离子抑制色谱法n通过改变流动相的pH值，使样品成中性n离子对色谱法n加入“对离子”，使样品呈中性4.7 离子抑制色谱离子抑制色谱v离子型化合物在反相色谱柱上不保留离子型化合物在反相色谱柱上不保留v改变流动相的改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离值，抑制样品离子的电离 一些酸在一些酸在pH低于低于2时还保持离子化时还保持离子化一些碱在一些碱在pH高于高于7时还保持离子化时还保持离子化v适用于弱酸性化合物的分离适用于弱酸性化合物的分离n降低流动相的pH值，使样品降低离子化n使用硅胶基质C18填料v使用条件应在填料基质的范围内使用条件应在填料基

28、质的范围内n硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内4.8 离子对色谱法离子对色谱法v在反相色谱流动相内加入在反相色谱流动相内加入“离子对离子对”试剂试剂n与样品中可电离的组份形成“对离子”n在反相色谱柱上分离离子型化合物v离子对试剂的类型离子对试剂的类型nPIC A：磷酸季丁铵，适用于弱酸nPIC B：烷基磺酸盐，适用于弱碱n烷基长度不同，形成对离子的能力不同n通常有：B5，B6，B7，B8nPIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱4.9 其它影响因素其它影响因素v 流速对柱效的影响流速对柱效的影响n不同内径的色谱柱有自己的最佳流速v 样品的进样量样品的进样量(浓度浓度)对柱效的影响对柱效的影响

29、v 样品的进样体积对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响v 溶剂粘度对柱效的影响溶剂粘度对柱效的影响以上因素均影响分离度以上因素均影响分离度 v v 5.梯度洗脱梯度洗脱v 定定义义：使流：使流动动相中含有相中含有两种两种或或两种两种以上不同以上不同极极性的溶性的溶剂剂，在洗在洗脱过脱过程程连续连续或或间断间断改改变变流流动动相的相的组组成，以成，以调节调节 它它的的极极性，使每性，使每种种流出的流出的组组分都有合适的容量因子分都有合适的容量因子 k 并并使使样样品中的所有品中的所有组组分可在最短的分析分可在最短的分析时间内时间内，以适用的分离以适用的分离获获得得圆满圆满的的选择选择性分离。性

30、分离。v 适用于：适用于：当样当样品中的第一品中的第一个组个组分的分的k 值和最后一个组分的值和最后一个组分的 k 值相差几十倍至上百倍时，使用梯度洗脱效果值相差几十倍至上百倍时，使用梯度洗脱效果 特特别别好。好。5.1 梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点v优点优点n单位时间的分离能力增加n检测灵敏度提高v缺点缺点n仪器设备要求高n不适合某些检测方式n柱需再生n定量分析的重复性较低5.2 梯度的洗脱方式梯度的洗脱方式v高压梯度及低压梯度高压梯度及低压梯度溶剂 A溶剂 B泵 A泵 B混合器A 高压梯度溶剂 A泵溶剂 B比例阀（溶剂混合点）混合器B 低压梯度（溶剂混合点）5.3 梯度洗脱的可变参数梯度洗

31、脱的可变参数v A及及B液的成分和化学特性液的成分和化学特性v 梯度的陡度梯度的陡度 v 梯度的变化形状梯度的变化形状12435678910115.4梯度曲线的变化梯度曲线的变化 凹线凹线v 梯度曲线的变化梯度曲线的变化 凸线凸线v 5.5 梯度条件的优化梯度条件的优化v 5.6 梯度平衡时间的影响梯度平衡时间的影响v 5.7 有机污染物的影响有机污染物的影响v 超纯水的有机物污染最少。尽量使用其做梯度洗脱v 典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析v “三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析5.8 梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第一步第一步v 开发一个有9个烷基苯酮化

32、合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100%水-乙腈)，分离不理想。整个 色谱峰组保留时间太长，分离度也不好 梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第二步第二步v 为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的 梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第三步第三步v 梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第四步第四步v 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确 梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第五步第五步v 根据“梯

33、度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来 梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第六步第六步v 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象 梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第七步第七步v 最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。6.定性和定量分析定性和定量分析v定性和定量方法的建立及论证定性和定量方法的建立及论证v 对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳偏差、回收率、样品的稳定

34、性、方法的稳 定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定 的分析方法的分析方法6.1 色谱峰定性色谱峰定性v鉴别每个色谱峰鉴别每个色谱峰n通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份n大多数情况下用比较保留时间来定性v即所谓：即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份6.2 色谱峰的确认色谱峰的确认v用用“标样标样”的保留值定出被测组份的位置的保留值定出被测组份的位置v进一步的确认进一步的确认 标准加入标准加入 同时用其他方法同时用其他方法n其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）n其他检测器nPDA，光谱图比较

35、、谱库检索nMS，质谱图解析、谱库检索n其他仪器方法6.3 定量分析的具体内容定量分析的具体内容v 确定样品的类型，主要成分确定样品的类型，主要成分/痕量成分痕量成分v 使分析条件的分离度（使分析条件的分离度（R）大于：）大于：1.5v 色谱峰的定性，峰一致性测定色谱峰的定性，峰一致性测定v 检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围v 用标样建立标准曲线用标样建立标准曲线v 检查方法的准确度及精确度检查方法的准确度及精确度v 用标样定期检查方法用标样定期检查方法6.4 痕量分析痕量分析v 如信如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：噪比不够，定量的精确度会

36、受影响，因此要：n分析前浓缩样品n选择高灵敏度检测器n用衍生法v 使色谱体系最优化使色谱体系最优化n使用短的微径柱（减少样品的稀释）n使用高效色谱柱n使k值尽可能小n增加进样体积和浓度n使用低流速（N增加）n采用梯度淋洗6.5 液相色谱定量精度的计算液相色谱定量精度的计算v测量精度的计算测量精度的计算)100(X%12)(X=CVNXiXNiX变异系数标准偏差平均值6.6 常用的定量方法常用的定量方法v 峰面积百分比法峰面积百分比法n由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用v 外标法外标法n在液相色谱中用的最多v 内标法内标法n准确，但是麻烦n在标准方法中用的最多6.7 峰面积百分比法定量峰面积

37、百分比法定量v公式：公式：v特点：特点：n各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点n与进样量无关n不需标样n简单v%100%=iAiAC6.8 外标法定量外标法定量v 配制一系列已知浓度的标样配制一系列已知浓度的标样 外标法定量（二）外标法定量（二）v 实际色谱图实际色谱图0.0 00.0 50.1 00.1 50.2 00.2 50.3 00.0 00.5 01.0 01.5 02.0 02.5 03.0 03.5 04.0 04.5 05.0 05.5 06.0 06.5 07.0 0M in u te s0.0 00.0 50.1 00.1 50

38、.2 00.2 50.3 00.0 00.5 01.0 01.5 02.0 02.5 03.0 03.5 04.0 04.5 05.0 05.5 06.0 06.5 07.0 0M in u te s0.0 00.0 50.1 00.1 50.2 00.2 50.3 00.0 00.5 01.0 01.5 02.0 02.5 03.0 03.5 04.0 04.5 05.0 05.5 06.0 06.5 07.0 0M in u te s05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样品浓度响应值峰面积()外标法定量（三）外标法定量（三）v 计算公式计算公式

39、v v 特点特点n无需各组份都被检出、洗脱n需要标样n标样及样品测定的条件要一致n进样体积要准确 iXiiiXARFCXRXCRFii样品响应值未知组分的浓度标样响应值标样浓度校正因子=)()()()(6.9 内标法定量（一）内标法定量（一）v 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样配制一系列浓度的标样，其中加有内标样 内标法定量（二）内标法定量（二）v 实际色谱图实际色谱图 0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.503.003.504.004.505.005.506.00voltsMinutesM ethylParabenEthylPara

40、benPropylParabenButylParaben05010015020025001020304050样品浓度标样峰面积内标样峰面积标准曲线 内标法定量（三）内标法定量（三）v 计算公式：计算公式：v 特点：特点：n无需各组份都被检出、洗脱n需要标样，需要内标样n结果与进样体积无关 内标法定量（四）内标法定量（四）v对内标物的要求对内标物的要求n化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)n在样品中不存在n不与样品中组份发生任何化学反应n保留值与待测组分接近n浓度（响应值）与待测组分相当n其色谱峰与其他色谱峰分离好6.10 定量校正曲线定量校正曲线v 曲线曲线A：n因在零浓度时仍有色谱峰，可

41、能有杂质未分开v 曲线曲线B：n在此浓度内，检测器的响应值是非线性的v 曲线曲线C：n可接受的理想状态，实际情况应是 其延长线到零点v 曲线曲线D：n表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也 可能是样品制备时的损失ABCD7方法的完善：论证和移植方法的完善：论证和移植v 一个良好的论证方案，通常先进行那些重要的研究，一个良好的论证方案，通常先进行那些重要的研究，并预测将来的需要。并预测将来的需要。v 其次进行稳定性和普适性的全面研究（也就是移植）。其次进行稳定性和普适性的全面研究（也就是移植）。v 方法研究的各组成部分包括：准确度，精密度，方法研究的各组成部分包括：准确度，精密度，线性，

42、范围，检测限，定量限，专属性。线性，范围，检测限，定量限，专属性。7.1论证标准（一）论证标准（一）v 1.1.准确度准确度 ：测定值和真值的接近程度。：测定值和真值的接近程度。以回收实验表示和确定；（以回收实验表示和确定；（1 1）与参比标准品比较；（）与参比标准品比较；（2 2）被测物）被测物 的标准品加入法；（的标准品加入法；（3 3）回收测定掺入空白基质中的被测物）回收测定掺入空白基质中的被测物v 2.2.精密度：重复该方法对均匀样品多次测定，各结果间精密度：重复该方法对均匀样品多次测定，各结果间 的一致程度。的一致程度。（1 1）重复性）重复性 （2 2）中间精密度）中间精密度 （3

43、 3）重现性）重现性v 3.3.线性：衡量响应值与浓度的校正曲线近似为一条直线性：衡量响应值与浓度的校正曲线近似为一条直 线的程度。线的程度。v 4.4.范围：方法有足够准确度，精密度和线性的最高和范围：方法有足够准确度，精密度和线性的最高和 最低浓度。最低浓度。论证标准（二）论证标准（二）v 5.5.检测限和定量限：被认为是任何方法的论证的重要组成检测限和定量限：被认为是任何方法的论证的重要组成部分。部分。两者受分离条件的影响：色谱柱，试剂，尤其是仪两者受分离条件的影响：色谱柱，试剂，尤其是仪器设备与数据系统。器设备与数据系统。v 6.6.专属性：大多数方法中最重要的指标：可定义为在其它专属

44、性：大多数方法中最重要的指标：可定义为在其它物质存在的条件下可准确测定被测物浓度的能力。物质存在的条件下可准确测定被测物浓度的能力。v 确保专属性的步骤确保专属性的步骤（1 1）掺入已知干扰物）掺入已知干扰物 （2 2）样品降解研究）样品降解研究 （3 3）峰收集后，再用其它技术对其分析）峰收集后，再用其它技术对其分析 （4 4）使用另外的色谱分离模式使用另外的色谱分离模式 （5 5）改变该）改变该HPLCHPLC方法的条件（如溶剂或梯度）方法的条件（如溶剂或梯度）7.2 方法移植方法移植v 1.1.方法的普适性：方法在实际应用条件下运行时，其结果方法的普适性：方法在实际应用条件下运行时，其结果的重现性。包括不同的分析人员，实验室，色谱柱，仪器，的重现性。包括不同的分析人员，实验室，色谱柱，仪器，化学试剂和溶剂来源等等。化学试剂和溶剂来源等等。v 2.2.稳定性：方法中使用的样品，标准品，试剂在一定时间稳定性：方法中使用的样品，标准品，试剂在一定时间内必须保持稳定。流动相和色谱柱的稳定。内必须保持稳定。流动相和色谱柱的稳定。v 已论证的方法要在其它实验室使用，因此要进行正式的方已论证的方法要在其它实验室使用，因此要进行正式的方法移植或实验室间的交叉研究。其中一个重要内容是测定法移植或实验室间的交叉研究。其中一个重要内容是测定结果是否等同。结果是否等同。Thank you！