pcr技术及其在食品中的应用课件.ppt

1、2022-8-8第八章第八章第八章第八章第八章第八章 PCRPCRPCR及及及及及及其在食品其在食品其在食品其在食品其在食品其在食品中的应用中的应用中的应用中的应用中的应用中的应用一一、转基因食品转基因食品二二.PCR.PCR技术技术三三.PCR.PCR在食品中的应用在食品中的应用2022-8-8你吃过转基因食品吗？不管您愿不愿意，您己经或正在把转基因食品吃进肚里2022-8-8 转基因食品已经走进我国百姓的生活。国内尚没有转基因作物的大规模生产 近几年我国大量从美国、阿根廷等国进口大豆，其中大部分是转基因大豆。我国有一半以上的大豆色拉油含有转基因成分。2022-8-8究竟什么是转基因食品？究

2、竟什么是转基因食品？究竟什么是转基因食品？究竟什么是转基因食品？究竟什么是转基因食品？究竟什么是转基因食品？转基因食品是否安全？转基因食品是否安全？转基因食品是否安全？转基因食品是否安全？转基因食品是否安全？转基因食品是否安全？它是否存在长期的隐患？它是否存在长期的隐患？它是否存在长期的隐患？它是否存在长期的隐患？它是否存在长期的隐患？它是否存在长期的隐患？2022-8-8主要内容主要内容主要内容主要内容主要内容主要内容 定义 发展 应用 安全性评价一一.转基因食品转基因食品2022-8-8What is Genetically ModifiedWhat is Genetically Modi

3、fiedWhat is Genetically Modified？什么是转基因？什么是转基因？什么是转基因？什么是转基因？什么是转基因？什么是转基因？将不同来源的DNA分子进行重组，克服了天然物种生殖隔离的屏障，将具有某种特性的基因分离和克隆，再转接到另外的生物细胞内。从而可以按照人们的意愿创造出自然界中原来并不存在的新的生物功能和类型。2022-8-8“转基因生物转基因生物转基因生物转基因生物转基因生物转基因生物”（Genetically Modified OrganismsGenetically Modified OrganismsGenetically Modified Organism

4、s）是指遗传物质基因被改变的生物，其基因改变的方式是通过转基因技术，而不是以自然增殖或自然重组的方式产生。简称：GMOs2022-8-8转基因生物的种类转基因生物的种类转基因生物的种类转基因生物的种类转基因生物的种类转基因生物的种类？目前已经进入食品领域的三类转基因生物包括：转基因动物 转基因植物（最多，最重要）转基因微生物 2022-8-8现在国内都有哪些转基因食品？现在国内都有哪些转基因食品？现在国内都有哪些转基因食品？现在国内都有哪些转基因食品？现在国内都有哪些转基因食品？现在国内都有哪些转基因食品？第一批列入目录的农业转基因生物是：大豆：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕 玉米：玉米

5、种子、玉米、玉米油、玉米粉 油菜：油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕 棉花种子 番茄：番茄种子、鲜番茄、番茄酱2022-8-8“转基因食品转基因食品转基因食品转基因食品转基因食品转基因食品”（Genetically Modified Foods)Genetically Modified Foods)Genetically Modified Foods)是指用转基因生物制造、生产的食品、食品原料及食品添加物等。简称：GMF2022-8-8为什么会对为什么会对为什么会对转基因食品转基因食品转基因食品有恐惧心理有恐惧心理有恐惧心理？据专家分析，转基因食品在基因重组与改据专家分析，转基因食品在基因重

6、组与改变过程中，可能产生某种毒性、过敏性，变过程中，可能产生某种毒性、过敏性，生成抗营养因子。引起营养成分改变，或生成抗营养因子。引起营养成分改变，或者某种抗抗生素基因随食品转移到肠道，者某种抗抗生素基因随食品转移到肠道，使抗生素对该机体从此失去疗效。使抗生素对该机体从此失去疗效。就目前而言，还没有发现转基因食品对人就目前而言，还没有发现转基因食品对人类有害，但同时也缺乏证据证明它的无害类有害，但同时也缺乏证据证明它的无害性，因此产生了一些争论。性，因此产生了一些争论。2022-8-8 从本质上讲，转基因生物和常规育种的品种从本质上讲，转基因生物和常规育种的品种是一样的是一样的 两者都是在原有

7、的基础上对某些性状进行修两者都是在原有的基础上对某些性状进行修饰，或增加新性状、或消除原有不利性状。饰，或增加新性状、或消除原有不利性状。有意识的杂交育种已有有意识的杂交育种已有100多年的历史多年的历史2022-8-8转基因植物的安全性争论转基因植物的安全性争论转基因植物的安全性争论转基因植物的安全性争论转基因植物的安全性争论转基因植物的安全性争论 支持派认为：如果转基因农业生物技术得不到社会支持，这一研究将被扼杀，并且强调，迄今为止并没有发现转基因食品危害人体健康和环境的确切证据。2022-8-8 美国人食用转基因食品已多年，超级市场上有4000多种商品是含有转基因植物成分的，还没有事例证

8、明人吃了以后会得病，甚至会引起死亡。加拿大、澳大利亚也是转基因食品的生产大国，均有几千万人在吃，到现在为止也没有个案例说明它有问题。2022-8-8反对派的观点反对派的观点反对派的观点反对派的观点反对派的观点反对派的观点 一英国科学家声称，转基因马铃薯会减弱老鼠免疫系统功能；美国康乃尔大学也发现，转基因玉米会危害蝴蝶幼虫及其相关生态环境。2022-8-8 环保团体认为这种违反自然的转基因作物及产品，未经长期安全测试，长期食用可能对人类及生态环境造成负面影响。尤其是注重环境和生态保护的欧盟国家，对转基因作物更加排斥，因而抵制美国GMO产品的进口。2022-8-8 改良和培育新产品，改良和培育新产

9、品，促进快速生长，缩短育种年限促进快速生长，缩短育种年限 提高产量和质量，提高产量和质量，增强抗逆性增强抗逆性(抗旱、寒、涝、热、病毒和抗旱、寒、涝、热、病毒和虫害等虫害等)，大大降低成本，大大降低成本，产出口味更佳的食物。产出口味更佳的食物。2022-8-8二二二二二二.PCR.PCR.PCR技术技术技术技术技术技术2022-8-8PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长2022-8-8PCR技术简史DNA的复制核

10、酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物2022-8-8PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚

11、合酶2022-8-8PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了2022-8-8PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗

12、时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖2022-8-8 2022-8-8PCRPCRPCR的基本原理的基本原理的基本原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。2022-8-8Target SequenceTarget Sequen

13、cePCR原理示意图原理示意图模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间左右一定时间后，使模板后，使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2022-8-8PCR Cycle PCR Cycle PCR Cycle 第二步第二步第二步第二步第二步第二步 Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DN

14、A经加热变性成单经加热变性成单链后，温度降至链后，温度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列单链的互补序列配对结合；配对结合；2022-8-8PCR Cycle PCR Cycle PCR Cycle 第三步第三步第三步 Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结引物结合物在合物在TaqDNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTP为反应原料，为反应原料，靶序列为模板，按靶序列为模板，按碱基配对与半保留碱基配对与半保留复制原

15、理，合成一复制原理，合成一条新的与模板条新的与模板DNA 链。链。2022-8-8End of the 1st PCR Cycle End of the 1st PCR Cycle End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceResults in two copies of target sequenceResults in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一每完成一个循环需个循环需24分钟，分钟，23小时小时就能将待

16、就能将待扩目的基扩目的基因扩增放因扩增放大几百万大几百万倍。倍。2022-8-8Target AmplificationTarget AmplificationTarget AmplificationNo.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=1

17、28 Amplicon2022-8-8PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应条件：反应条件：10X缓冲液 10 L4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12gTaq DNA聚合酶 2.5UMg2+1.5mmol/L2022-8-8PCR仪2022-8-8PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时

18、完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA2022-8-82022-8-82022-8-82022-8-8 2022-8-8PCRPCRPCR技术的主要类型技术的主要类型技术的主要类型反向PCR 锚定PCR不对称PCR 原位PCRRT-PCR 重组PCR差异显示PCR免疫PCR实时定量PCR多重PCR2022-8-8三三三三三三.PCR.PCR.PCR在食品中的应用在食品中的应用在食品中的应用在食品中的应用在食品中的应用在食品中的应用 食品微生物检测食品微生物检测 转基因食品的检测转基因食品的检测2022-8-8第八章第八章

19、第八章第八章第八章第八章 生物芯生物芯生物芯生物芯生物芯生物芯片及其在食品片及其在食品片及其在食品片及其在食品片及其在食品片及其在食品中的应用中的应用中的应用中的应用中的应用中的应用一一、生物芯片简介生物芯片简介二二.生物芯片在食生物芯片在食品中的应用品中的应用2022-8-8一一一一一一.生物芯片简介生物芯片简介生物芯片简介生物芯片简介生物芯片简介生物芯片简介 美国科学杂志将生物芯片评选为美国科学杂志将生物芯片评选为1998 年世界科技十大突破之一年世界科技十大突破之一。2022-8-8生物芯片的发展历程生物芯片的发展历程生物芯片的发展历程生物芯片的发展历程生物芯片的发展历程生物芯片的发展历

20、程 各国企业与政府均瞄准这一新兴产业，纷纷 投入巨资建立研发机构。中国政府决定于中国政府决定于2000、2001年在北京与上海分别建立生年在北京与上海分别建立生物芯片国家工程研究中心。物芯片国家工程研究中心。近年来美国FDA批准了二款可以用于临床检测的芯片产品,开始了生物芯片由研究市场向临床诊断市场的转变。2022-8-8 1996年至今，共有13,000 多篇微阵列芯片相关论文发表，其中1,000 多篇发表在Cell、Nature（及姊妹刊）、Science 等国际顶级学术刊物上。2022-8-81.11.11.1什么是生物芯片什么是生物芯片什么是生物芯片什么是生物芯片什么是生物芯片什么是生

21、物芯片(Biochips)Biochips)Biochips)？生物芯片是将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特异性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分子各种生物分子存在的量的一种技术。能对小分子、生物大分子、细胞和组织等进能对小分子、生物大分子、细胞和组织等进行高通量快速、并行处理和分析的微型器件行高通量快速、并行处理和分析的微型器件2022-8-81.2生物芯片的类型：生物芯片的类型：生物生物芯片芯片DNA芯片芯片蛋白质芯片蛋白质芯片组织芯片组织芯片细胞芯片细胞芯片其它芯片其它芯片样品制备芯片样品制备芯片核酸扩增芯片核酸

22、扩增芯片毛细管电泳芯片毛细管电泳芯片微缩芯片实验室微缩芯片实验室2022-8-8生物芯片的分类生物芯片的分类生物芯片的分类生物芯片的分类生物芯片的分类生物芯片的分类 根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。2022-8-8 1.载体载体:生物芯片的固相支持基质生物芯片的固相支持基质.要求要求:a.载体表面必须具有可以进行化学反应的活性物质载体表面必须具有可以进行化学反应的活性物质 b.使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量。使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量。c.载体性能不会干扰生物分子的功

23、能，具有足够的稳载体性能不会干扰生物分子的功能，具有足够的稳定性。定性。d.有良好的生物兼容性有良好的生物兼容性.e.具有良好的光学性质，能适应透射光或反射光的测具有良好的光学性质，能适应透射光或反射光的测量。量。1.3 1.3 1.3 生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作2022-8-8生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作载体的材料载体的材料在制作生物芯片时，载体材料很多，大致可分为四类：1无机材料2天然有机聚合物3人工合成的有机 高分子聚合物4各种高分子聚合 物制成的各种膜2022-8-8载体的

24、预处理载体的预处理1、实性材料支持物的预处理、实性材料支持物的预处理 硅片、硅片、玻璃片、玻璃片、瓷片、聚丙烯酰胺凝胶、瓷片、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯微珠、磁性微珠等。聚苯乙烯微珠、磁性微珠等。预处理：预处理：表面衍生出羟基、氨基等活性基团。这些基表面衍生出羟基、氨基等活性基团。这些基团在合成前用光敏保护基保护起来。团在合成前用光敏保护基保护起来。氨基硅烷化或包被多聚赖氨酸。氨基硅烷化或包被多聚赖氨酸。2022-8-82、膜性材料支持物、膜性材料支持物 聚丙烯膜、尼龙膜、硝基纤维素膜、聚丙烯膜、尼龙膜、硝基纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜（聚偏二氟乙烯膜（PVDF）等。等。预处理：预处理：包被氨基硅烷

25、或多聚赖氨酸。包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。2022-8-8生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作 2.2.制备方法制备方法原位合成法原位合成法点样法点样法光刻光刻DNA合成法合成法压电喷印法压电喷印法分子印章法分子印章法2022-8-8生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作2022-8-8蛋白质芯片流程蛋白质芯片流程蛋白质芯片流程蛋白质芯片流程蛋白质芯片流程蛋白质芯片流程探针蛋白探针蛋白(抗原抗原.抗体等抗体等)的制备的制备固相载体的选择固相载体的选择固相载体表面化学处理固相载体表面化学处理蛋白质固定化蛋

26、白质固定化封闭封闭反应与样品检测反应与样品检测数据处理机统计分析数据处理机统计分析2022-8-8生物芯片的优点生物芯片的优点生物芯片的优点生物芯片的优点生物芯片的优点生物芯片的优点 基因芯片的最大优点在于其高通量。传统方法检测众多基因要经历多次实验而且自动化程度低，因而每次实验之间是存在系统误差的。基因芯片可以克服这个缺点，众多基因的探针的标记、杂交等过程是在一次实验过程中完成的，而且自动化程度高，数据客观可靠。2022-8-8我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状 生物芯片北京国家工程

27、研究中心（16#地、总建筑面积30224平方米 位于中关村生命科学园）北京博奥生物芯片有限责任公司承建。该项目是建设生物芯片微加工相关条件、分子生物学、化学、光学等实验室分析条件及相关辅助设施，形成年产生物芯片分析系统120台、应用型生物芯片90万片的生产能力。2022-8-8我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状我国生物芯片行业发展现状 而到目前，中国生物芯片的产值就达到了2亿多元人民币，生物芯片研究已经从实验室进入应用阶段。2022-8-8三三三三三三.生物芯片在食品中的应用生物芯片在食品中的应用生物芯片在食品中的应用生物芯片在食品中的应用生物芯片在食品中的应用生物芯片在食品中的应用 食品微生物检测食品微生物检测 转基因食品的检测转基因食品的检测