[物理]色谱分离第二章课件.ppt

1、第第2章章 平面色谱平面色谱2.1概述2.2滤纸及薄层板2.3平面色谱的流动相（展开剂）2.4平面色谱的操作方法2.5高效薄层色谱法（HPTLC）2.1.1平面色谱法的分类与原理 平面色谱是一种开放式的离线操作色谱，分类如下：1.纸色谱法2.薄层色谱法3.薄层电泳法2.1概述纸色谱法 以滤纸为载体的液相色谱法。滤纸中的纤维素能吸收2025%的水分，其中6%左右的水分通过氢键与纤维素上的羟基相结合，形成液-液色谱中的固定相。固定相：滤纸上的结合水流动相：与水不相溶（或部分相溶）的溶剂分离原理：被分离物质在两相中的分配系数不 同而分离.薄层色谱法 将固定相于玻璃或铝箔等载板上涂布成均匀的薄层。展开

2、剂（流动相）借助毛细作用从薄层板点样的一端展开到另一端时使不同物质得到分离。分离原理随固定相不同而异，可分为吸附薄层、分配薄层、离子交换薄层 以及凝胶薄层等。电泳法 电泳：带电粒子在直流电场作用下向异性电极移动。电泳法:带电荷的被分离物质在纸、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等惰性支持介质上，由于粒子的大小不同以及所带的电荷种类、数量不同，在一定电场的作用下，向电荷相反的电极方向以不同速度迁移而得到分 离。比移值Rf是溶质移动距离与 流动相移动距离之比，即 X:原点与斑点中心的距离;Y:斑点中心与溶剂前沿的距离 Rf=1时，组分随展开剂移至溶剂前沿Rf=0时，组分留在原点所以,Rf的数值在01之间f

3、xRxy原点中心与斑点中心的距离原点中心与溶剂前沿的距离1.比移值Rf2.1.2保留值若Rf 值的重现性较差时，可将被分离物质与一 参比物在同一薄层分离。参比物比移值Rf(i)与被测 物比移值Rf(s)之比称为相对比移值。Ri,s的重现性优于Rf值，数值可大于或小于1。sfifsi,RRR2.相对比移值3.分配系数与比移值的关系 两相达到分配平衡时，某组分在固定相中的浓度（Cs）与在流动相中的浓度（Cm）之比称为分配 系数KD，即msDCCK Rf与 KD 的关系可推导如下：设x为溶质斑点中心的移动距离，y为斑点中心与溶剂前沿的距离。smCyCx即x=rCm即=yr”CsDmsrKCrCrxy

4、 式中：r为与固定相截面积As和流动相截面积Am有关的常数。r=As/Am 一定条件下，Am、As为定值,所以Rf的大 小主要决定于KD。每种物质在一定条件下 KD值不变，所以Rf值可以作为定性的依据。sDmmDmsmmfDmsfAKAAKAAAA1RKAA1xyxR12.1.4平面色谱的特点与GC和HPLC的比较:a.试样随流动相移动一定的距离即停止，不被洗脱;b.流动相的流速不恒定，且无法控制;c.仪器自动化程度、分辨率、重现性较差.平面色谱独有的优点:a.操作简单，价格便宜，应用范围广;b.样品预处理简单，且不会造成检测失落，对未知试样的分析很有利;c.可同时平行分离多个试样;d.对成份

5、复杂的试样可采用不同类型的流动相双向展开，提高分离效能.2.2.1滤纸纸色谱中所用的滤纸性质对分离效果有很大影响。对滤纸的要求是：1.物理性质均匀、质地均一、厚薄一致，否则斑点畸形，Rf值改变;2.具有一定的机械强度;3.纤维松紧程度适当;4.具有一定的纯度;5.纸面洁净，不含有溶于水及有机溶剂的物质。2.2滤纸及薄层板 色谱用滤纸纤维的方向会影响组分的分离，色谱用滤纸纤维的方向会影响组分的分离，故每次展开时故每次展开时,滤纸的纤维方向应一致滤纸的纤维方向应一致.商品滤纸有厚纸、薄纸、慢速、快速、中商品滤纸有厚纸、薄纸、慢速、快速、中速等不同类型可供选择速等不同类型可供选择.2.2.2薄层板有

6、资料表明，60%以上的薄层分离用硅胶作为吸附剂，其次为纤维素、氧化铝、聚酰胺、硅藻土等。固定相硅胶 硅胶是一种弱酸性的多孔性无定形吸附剂。硅胶表面有很多硅醇基(SiOH)，通过硅原子上的-OH基团与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而表现出吸附性能。硅醇基的数目越大，则吸附能力增强。硅胶也能吸附水分而成为水合硅醇基。OH2SiOH+H2OSiOH 硅胶的含水量越大，吸附活性越低，吸附能力（活性、活度）一般分为五级：活度级别含水量%-10121520 当游离水含量高达17%以上时，吸附能力很低。将硅胶加热到150 左右时，能可逆性地失去吸附水分而增加活性。C。若加热温度大于500 ，则硅胶不可逆地

7、失去结合水形成硅氧烷结构：C。若加热至1100 ，则结合水全失，完全失去吸附能力。若通过化学反应，将有机分子以共价键连接到硅醇基上，则称为化学键合相。按键合到有机硅烷的官能团不同，又可以分为极性键合相和非极性键合相。C。SiOH2-H2OSiOSi氧化铝氧化铝由氢氧化铝高温脱水而成。按制备方法不同，氧化铝可分为三种：碱性氧化铝：pH=910,可分离合成染料，生物碱等酸性氧化铝：pH=45，适应于酸性物质的分离中性氧化铝：pH=77.5，适于分离醛酮，以及对酸碱 不稳定的脂和内酯等化合物氧化铝的活度与其含水量有关，含水量大，则吸附能力小。活性级别含水量%-361015纤维素纤维素分子中带有许多羟

8、基，亲水性强，分离原理与纸色谱相似，但分离效果和分离速度均比纸色谱佳，可以代替纸色谱.普通纤维素：天然纤维素、高纯度纤维素、微晶纤维素。乙酰化纤维素：用乙酸将纤维素结构上的羟基酯化而成，适用于反相色谱。离子交换纤维素：纤维素经化学反应，使分子中一部分羟基上的氢被阳离子或阴离子交换基取代而成，具有离子交换树脂的性质。纤维素的种类有：聚酰胺 聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物。薄层色谱中常用的聚己内酰胺，结构如下：酰胺中心的酰胺基可与酚类、酸类、硝基类等化合物形成氢键而对这些物质产生吸附作用。应用：蛋白质、肽、多糖、核苷酸等的分离。-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C-N-nHO葡聚糖葡

9、聚糖是一种由葡萄糖残基构成的多糖物质。葡聚糖是一种由葡萄糖残基构成的多糖物质。葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖悬浮于有葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖悬浮于有机相中，加入交联剂交联聚合而成。机相中，加入交联剂交联聚合而成。在葡聚糖分子上引入有机基团，则可成为亲脂性在葡聚糖分子上引入有机基团，则可成为亲脂性凝胶。凝胶。在葡聚糖凝胶上引入羧甲基、磺乙基等，则制成在葡聚糖凝胶上引入羧甲基、磺乙基等，则制成具有离子交换性质的葡聚糖凝胶离子交换剂。具有离子交换性质的葡聚糖凝胶离子交换剂。应用：蛋白质、肽、多糖、核苷酸等的分离应用：蛋白质、肽、多糖、核苷酸等的分离薄层板的种类载板材料：玻璃片、铝箔、塑料片

10、等薄层板类型：1.硬板：在固定相中加入粘合剂（煅石膏、淀粉）;2.软板：不加粘合剂;3.烧结玻璃板：将玻璃粉与硅胶、氧化铝等吸附 剂按一定比例混合后，以丙酮、乙醇或水等溶剂 调成匀浆，涂成薄层，经高温烧结而成。吸附剂及预制板包装上的符号及含义 G加入一定的煅石膏作粘合剂 H不加粘合剂，供制各种软板用 F254加入对254nm波长能发荧光的物质 F254s加入抗酸性荧光指示剂2.3平面色谱的流动相（展开剂）纸色谱的流动相通常由两种或两种以上的溶剂组成，其中以三元溶剂较为多见。2.3.1纸色谱的流动相多元溶剂系统中各组分按其性能可分为三类：第一类：对被分离物质溶解度很小的有机 溶剂；第二类：对被分

11、离物质溶解度很大的溶剂,用于调节各组分的Rf值，使各组分 均匀地分布在纸上。第三类：调节溶剂系统的pH值或调节各组分 之 间的比例。例：分离氨基酸的溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：22.3.2薄层色谱的流动相（展开剂）流动相可用单一溶剂或混合溶剂。根据被测物的极性和吸附剂的活性（度）进行选择。Stahl设计了一个选择薄层展开剂的简图吸附剂活度小展开剂强极性极性物质吸附剂活度大展开剂非极性非极性物质 电泳的展开剂一般为缓冲溶液。2.4.1点样薄层板：20cm20cm滤纸长度：2025cm，宽度以样品个数决定。溶液浓度：0.011%原点直径：35mm原点间距离：23cm点样体积：15点样量：

12、1030点样方式：点状点样、带状点样点样设备：毛细管、微量注射器、自动点样装置Lg2.4平面色谱的操作方法2.4.2 展开展开前色谱床及层析缸应先用溶剂蒸汽饱和平衡。展开方式：上行展开、下行展开、径向展开、水平展开（溶剂从两边向中间展开）.优点：操作简单，重现性好.缺点：展开时间较长 上行展开法 径向展开法（水平法）展开速度较上行法快 径向展开法 2.4.3定位与定性 定位方法1.喷洒显色法：将显色剂溶液用喷雾器均匀喷洒在色谱床上;2.熏蒸显色法：把滤纸或薄层板放入充满碘蒸气或氨水的密闭容器内使之显色;3.紫外光显色法：含共轭双键的有机物可吸收紫外光显出暗色斑点或辐射出荧光。双向展开法 点样后

13、先用溶剂A使原点向垂直方向展开,至溶剂达到前沿后停止(图b);用溶剂B再向与原方向垂直的另一方向展开,最后组分斑点将按45方向分布(图c)a 色谱床的影响sDmmfAKAAR Rf决定于物质的KD和两相的截面积.滤纸的厚薄及其松紧程度、吸附剂的粒度均影响Rf值。定性方法：（1）斑点的Rf值（或泳动距离）定性 影响Rf值（或泳动距离）的因素:b 相对湿度的影响吸附剂的活度随相对湿度的增大而降低。20cm20cm的硅胶薄层板在50%的相对湿度中：放置3分钟 失去活性一半 放置15分钟 吸附水分达最大值薄层在相对湿度为1-80%的情况下展开，Rf值可以相差3倍。最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性

14、，极性越大，相对湿度范围也相应增大。c 溶剂系统的影响 溶剂系统不同，组分的分配系数不同，故Rf值不同。在平面电泳中，溶液的离子强度增大，组分的泳动速度减小。d 温度的影响 温度影响物质的分配系数KD，同时也影响纤维的水合作用，改变固定相的量。e pH值的影响 pH值影响组分的电离情况，可以改变组分的移动距离，甚至移动方向。草酸:COOHCOOHCOOCOOHCOOCOO值最大fRfR值最小展开后出现三个斑点 电离度增大，极性增大，在极性较强的一相中溶解度增大。解决方法：可以加入强酸抑制电离。为控制电泳速度，必须使用缓冲溶液 对于两性物质，溶液的pH值可以影响其所带的电荷，故而影响电泳方向。R

15、CCOO-NH2H+RCCOO-NH3+RCCOOHNH3+pH等电点 pH等电点 pH等电点 向正极移动 不动 向负极移动f 电渗的影响 在电场中，液体对于一个固定的固体表面作相对运动称为电渗，移动的速度称为电渗速度。质点的实际泳动速度应等于粒子本身的泳动速度与电渗速度的向量和。所以，中性物质在电场中也可能移动 g 其他因素展开方式、点样位置、展开距离、样品浓度等（2）斑点的显色特性 观察斑点的颜色或荧光，或用专属指示剂显色与对照品比较定性.（3）斑点的原位光谱扫描a 紫外可见光扫描颜色斑点:400780nm扫描斑点有紫外吸收:200400nm扫描斑点的扫描光谱与比较品的扫描光谱比较定性。b 三维光谱扫描 用平面色谱对粗提物进行分离与纯化，然后再用其他方法分析、鉴定。（4）与其他分析技术联用（1）半定量a 目测比较法 将一系列已知浓度的对照品溶液与一定量已知浓度的样品溶液点在同一色谱床上，经展开定位之后，根据样品与对照品中组分斑点的颜色深浅和面积大小估计含量。2.4.4定量方法b 限量检查法 用已知对照品溶液与供试品溶液分别点样、展开、显色、检查供试品中所含对照品的限度。此种方法普遍用于合成药物的纯度检查。（2）定量a 间接定量法（洗脱测定法）用溶剂将化合物的斑点定量地洗脱下来，然后用适当的方法测定。b 直接测量（原位薄层扫描法）