不同细胞基质狂犬病疫苗的优缺点探讨-课件.ppt

1、不同细胞基质培养狂犬不同细胞基质培养狂犬病疫苗优缺点探讨病疫苗优缺点探讨中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所董关木董关木一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、二倍体细胞培养疫苗、二倍体细胞培养疫苗 2、原代细胞培养疫苗、原代细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白、人白蛋白 2、抗生素、抗生素 3、明胶、明胶 4、牛血清、牛血清 5、防腐剂、防腐剂四、暴露后处理的失败案例四、暴露

2、后处理的失败案例一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、原代细胞培养疫苗、原代细胞培养疫苗 2、二倍体细胞培养疫苗、二倍体细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白、人白蛋白 2、抗生素、抗生素 3、明胶、明胶 4、牛血清、牛血清 5、防腐剂、防腐剂四、暴露后处理的失败案例四、暴露后处理的失败案例Fenje et al原代地鼠肾细胞疫苗原代地鼠肾细胞疫苗Wiktor et al人二倍体细胞培

3、养疫苗人二倍体细胞培养疫苗Kondo et al鸡胚细胞培养疫苗鸡胚细胞培养疫苗Montagnon et alVero传代细胞培养疫苗传代细胞培养疫苗David Semple成年羊脑组织疫苗成年羊脑组织疫苗Fuenzalida et al乳鼠脑组织疫苗乳鼠脑组织疫苗Powel et al鸭胚疫苗鸭胚疫苗我国目前人用狂犬病疫苗我国目前人用狂犬病疫苗 一、我国生产的狂犬病疫苗一、我国生产的狂犬病疫苗 1、地鼠肾原代细胞纯化疫苗、地鼠肾原代细胞纯化疫苗aG株株 2、Vero细胞纯化疫苗细胞纯化疫苗aG株株 3、Vero细胞纯化疫苗细胞纯化疫苗CTN株株 4、Vero细胞纯化疫苗细胞纯化疫苗PM株株

4、二、进口疫苗二、进口疫苗 1、法国、法国Vero细胞纯化疫苗细胞纯化疫苗PM株株 2、德国鸡胚细胞纯化疫苗、德国鸡胚细胞纯化疫苗Flury-LEP 中国药品生物制品检定所细胞培养疫苗的推进细胞培养疫苗的推进 80年代由于细胞培养疫苗价格昂贵，仅在美国、欧洲年代由于细胞培养疫苗价格昂贵，仅在美国、欧洲和加拿大使用，各种疫苗的比率和加拿大使用，各种疫苗的比率 细胞培养疫苗细胞培养疫苗7 羊脑疫苗占羊脑疫苗占64 乳鼠脑疫苗占乳鼠脑疫苗占29 2004年年WHO强烈推荐，停止使用脑组织疫苗，至今非强烈推荐，停止使用脑组织疫苗，至今非洲、南美使用脑组织疫苗。洲、南美使用脑组织疫苗。中国中国1980年代

5、已实现了细胞培养疫苗年代已实现了细胞培养疫苗一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、原代细胞培养疫苗、原代细胞培养疫苗 2、二倍体细胞培养疫苗、二倍体细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白、人白蛋白 2、抗生素、抗生素 3、明胶、明胶 4、牛血清、牛血清 5、防腐剂、防腐剂四、暴露后处理的失败案例四、暴露后处理的失败案例原代细胞原代细胞 原代细胞最初来源于供体的正常组织细原代细胞最初来源

6、于供体的正常组织细胞后在体外的首次培养的细胞，在适宜的培养胞后在体外的首次培养的细胞，在适宜的培养条件下细胞可以基本不改变性状而获得可以连条件下细胞可以基本不改变性状而获得可以连续传代的特性，但不能无限期分裂繁殖，为有续传代的特性，但不能无限期分裂繁殖，为有限生命，没有肿瘤原性。限生命，没有肿瘤原性。原代细胞的种类和生产的疫苗原代细胞的种类和生产的疫苗 鸡胚细胞鸡胚细胞 地鼠肾细胞地鼠肾细胞原代狗肾细胞原代狗肾细胞原代猴肾细胞原代猴肾细胞原代兔肾细胞原代兔肾细胞原代牛肾细胞原代牛肾细胞狂犬病疫苗狂犬病疫苗 麻疹疫苗麻疹疫苗 狂犬病疫苗、狂犬病疫苗、乙型脑炎、乙型脑炎、森林脑炎、肾综合征出血热森

7、林脑炎、肾综合征出血热狂犬病疫苗狂犬病疫苗 小儿麻痹疫苗小儿麻痹疫苗风疹疫苗风疹疫苗轮状病毒疫苗轮状病毒疫苗地鼠肾原代细胞培养生产狂犬病疫苗地鼠肾原代细胞培养生产狂犬病疫苗病毒株：病毒株：aG株，须使株，须使用豚鼠脑毒种用豚鼠脑毒种肾脏粉碎浓缩纯化浓缩纯化制备成疫苗制备成疫苗1、病毒株中国自行建立，是国际上最早的细胞疫苗之一。、病毒株中国自行建立，是国际上最早的细胞疫苗之一。2、经历了淡苗、浓缩苗和目前的纯化疫苗三个阶段。、经历了淡苗、浓缩苗和目前的纯化疫苗三个阶段。3、病毒株传代过度，免疫原性少差，浓缩倍数高，、病毒株传代过度，免疫原性少差，浓缩倍数高，4、生产用毒种为豚鼠脑，有潜在的脑组织

8、引起的过敏反应、生产用毒种为豚鼠脑，有潜在的脑组织引起的过敏反应,5、灭活剂为甲醛，疫苗中的残留可能引起注射部位疼痛。、灭活剂为甲醛，疫苗中的残留可能引起注射部位疼痛。病毒灭活无菌取肾收获病毒纯化鸡胚细胞疫苗（纯化鸡胚细胞疫苗（PCEC）病毒株：病毒株：Flury-Lep胚胎粉碎胚胎粉碎接种方案接种方案:每次每次1 ml5次注射次注射 原代鸡胚细胞培养，无致肿瘤潜在风险；原代鸡胚细胞培养，无致肿瘤潜在风险；使用使用SPF鸡鸡胚，无特定病原体，细胞安全性好；胚，无特定病原体，细胞安全性好；SPF鸡鸡蛋成本高，疫苗价格高；蛋成本高，疫苗价格高；疫苗纯化疫苗纯化降低了降低了宿主细胞宿主细胞蛋白，蛋白

9、，但但鸡蛋过敏者鸡蛋过敏者仍须慎重使用；仍须慎重使用；病毒株在鸡胚细胞中产量较低，生产成本较高。病毒株在鸡胚细胞中产量较低，生产成本较高。剂量大，每剂量剂量大，每剂量1ml。病毒病毒浓缩浓缩纯化纯化SPF鸡胚病毒收获病毒收获病毒灭活病毒灭活原代细胞原代细胞优点：优点：细胞的生物学形状基本与母体一致，染色体核型和细胞的生物学形状基本与母体一致，染色体核型和 基因基本没有改变，没有致肿瘤的风险基因基本没有改变，没有致肿瘤的风险缺点：缺点：由多种类型的细胞组成，细胞种类比较复杂，细胞间特性由多种类型的细胞组成，细胞种类比较复杂，细胞间特性存在差异；存在差异；动物的个体间存在差异，难以保证细胞质量的一

10、致性；动物的个体间存在差异，难以保证细胞质量的一致性；需要建立符合要求的动物繁殖设施，污染环境有悖需要建立符合要求的动物繁殖设施，污染环境有悖3R原则原则 原代细胞培养的营养条件要求较高原代细胞培养的营养条件要求较高 不能进行生物反应器现代化大规模培养不能进行生物反应器现代化大规模培养 外源致病微生物污染的风险较大外源致病微生物污染的风险较大二倍体细胞疫苗二倍体细胞疫苗二倍体细胞二倍体细胞具有正常二倍体（具有正常二倍体（2n）染色体的数目，核型正常；）染色体的数目，核型正常；在培养条件下，不能无限期的分裂繁殖；在培养条件下，不能无限期的分裂繁殖；无肿瘤原性，保留原体内细胞特性。无肿瘤原性，保留

11、原体内细胞特性。常见的二倍体细胞：常见的二倍体细胞：WI-38 IMR-90 MRC-5 2BS KMB-17 二倍体细胞代次的计算：二倍体细胞代次的计算：以细胞群体倍增为计算单位，当一瓶细胞长满达到一定数量时，以细胞群体倍增为计算单位，当一瓶细胞长满达到一定数量时，进行细胞传代使一瓶分种为二瓶，到该二瓶细胞长满分别达到进行细胞传代使一瓶分种为二瓶，到该二瓶细胞长满分别达到 原来的细胞数量时为一代，如原来的细胞数量时为一代，如1：4传代即为二代传代即为二代。二倍体细胞疫苗二倍体细胞疫苗 缺点：缺点：不能无限繁殖，不能无限繁殖，培养条件要求高，培养条件要求高，疫苗生产时病毒产量较低，生产成本较高

12、。疫苗生产时病毒产量较低，生产成本较高。目前不能大规模生物反应器培养目前不能大规模生物反应器培养 优点：优点：为正常二倍体细胞，无肿瘤原性，为正常二倍体细胞，无肿瘤原性，可建立细胞库可建立细胞库 无外源因子污染，质量可高度控制，无外源因子污染，质量可高度控制，生产纯化时无须考虑细胞生产纯化时无须考虑细胞 DNA 不用大量动物不用大量动物 与人抗原性一致，过敏反应小，安全可靠。与人抗原性一致，过敏反应小，安全可靠。人二倍体细胞狂犬病疫苗人二倍体细胞狂犬病疫苗(HDCV)过滤过滤超率超率灭活灭活纯化纯化稳定稳定 冻干冻干细胞种子批细胞种子批MRC 5 第第16 代代病毒株病毒株PM 1503-3

13、M终产品终产品 1 ml/剂剂优点优点 WHO 推荐的狂犬病疫推荐的狂犬病疫苗苗 金标准金标准 免疫原性高免疫原性高 PET体现的效价高体现的效价高 安全性高安全性高缺点缺点 不可能大规模生产不可能大规模生产 病毒产量低病毒产量低 生产时间长生产时间长 需要病毒抗原高度浓缩需要病毒抗原高度浓缩 复杂的时间控制使生产复杂的时间控制使生产难度加大难度加大 价格昂贵价格昂贵传代细胞传代细胞 传代细胞称细胞系（传代细胞称细胞系（XXXcell line)，最初来源与正常组织或，最初来源与正常组织或肿瘤组织，在原代细胞培养成功的基础上进行传代培养，肿瘤组织，在原代细胞培养成功的基础上进行传代培养，培养条

14、件合适时可以连续传代，在某一传代过程中改变了培养条件合适时可以连续传代，在某一传代过程中改变了原来的形态和性状，可以无限期传代，传代细胞系往往具原来的形态和性状，可以无限期传代，传代细胞系往往具有致肿瘤性有致肿瘤性 用于疫苗生产和研发的传代细胞用于疫苗生产和研发的传代细胞 Vero BHK CHO等等 年代年代 管理机构管理机构 细胞细胞 1954 AF流行病学委员会流行病学委员会 猴肾细胞猴肾细胞 1967 NIH 考虑使用人二倍体细胞考虑使用人二倍体细胞 1978 NIH 考虑肿瘤细胞（如考虑肿瘤细胞（如Namalwa 细胞产干扰素）细胞产干扰素）1984 NIH/FDA DNA、病毒、转

15、化蛋白等、病毒、转化蛋白等DNA10pg/剂剂 1986 WHO专门研究小组专门研究小组 DNA、病毒、转化蛋白等、病毒、转化蛋白等DNA100pg/剂剂 1996 WHO ECBS DNA 10ng/剂剂 1999 FDA NIH WHO IABS DNA风险未能明确风险未能明确 2004 FDA NIH WHO IABS 表述统一一致表述统一一致 2006 WHO 开始修订开始修订WHO细胞基质的规程细胞基质的规程 优点：优点：传代细胞系，几乎可以取之不竭传代细胞系，几乎可以取之不竭已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产，细胞库一经已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产，细胞库一经 建立，

16、细胞质量可高度控制，该细胞生长条件要求不高，建立，细胞质量可高度控制，该细胞生长条件要求不高，容易培养繁殖；容易培养繁殖；可用生物反应器大规模生产可用生物反应器大规模生产大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖疫苗生产是不要动物疫苗生产是不要动物 缺点：缺点：由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；疫苗必须纯化，且细胞疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准（含量须达到标准（10ng/剂）剂）目前不适合活疫苗的生产目前不适合活疫苗的生产 传代传代细胞用于疫苗生产的优缺点细胞用于疫苗生产的优缺点 生物反应器大规模细胞悬浮培养生产疫苗生物反应

17、器大规模细胞悬浮培养生产疫苗细胞库中取种细胞库中取种子细胞复苏子细胞复苏从方瓶中扩从方瓶中扩增至转瓶增至转瓶扩增到微扩增到微载体大罐载体大罐接种病毒种子接种病毒种子 aG株（中国）株（中国）CTN株（中国）株（中国）PV株（巴斯德）株（巴斯德）PM株（巴斯德）株（巴斯德）多次收获病毒液多次收获病毒液浓缩，灭活纯化浓缩，灭活纯化成品疫苗成品疫苗 DNA 细细 胞胞毒毒 种种处理动物，选取所用组织处理动物，选取所用组织清洗组织，剪碎，清洗组织，剪碎，用自然沉降法清洗用自然沉降法清洗加胰酶消化组织加胰酶消化组织培养液分散成细胞培养液分散成细胞培养液，牛血清，培养液，牛血清，抗生素抗生素，调节，调节p

18、H分装转瓶培养分装转瓶培养预留预留5或至少或至少500ml作对照作对照观察观察14天或至天或至病毒液收获结束病毒液收获结束毒种检定毒种检定无菌试验无菌试验 浸浸 泡泡洗洗 换换清除牛血清清除牛血清抗菌素抗菌素培培 养养收获病毒液收获病毒液 可多次可多次病毒滴定病毒滴定无菌试验无菌试验支原体支原体不同灭活剂、灭不同灭活剂、灭活方法、程序活方法、程序浓浓 缩缩灭灭 活活膜过滤，截留量大小、倍数膜过滤，截留量大小、倍数灭活验证试验灭活验证试验最敏感方法最敏感方法立即取样立即取样合合 并并传代细胞扩增传代细胞扩增 接种接种无牛血清无牛血清培养液培养液传代细胞工作库传代细胞工作库细胞复苏细胞复苏转下页转

19、下页柱层析柱层析 单柱、多柱单柱、多柱 区带离心区带离心其它方法其它方法纯纯 化化无菌试验无菌试验抗原含量测定抗原含量测定蛋白量测定蛋白量测定牛清蛋白牛清蛋白DNA配配 制制人白蛋白人白蛋白防腐剂防腐剂佐剂佐剂半成品半成品 成成 品品抗生素抗生素 NO冻冻 干干液液 体体鉴别试验鉴别试验外观外观化学化学 pH 防腐剂防腐剂 水份水份 佐剂佐剂效力试验效力试验热稳定试验热稳定试验无菌试验无菌试验细菌内毒素或热源细菌内毒素或热源异常毒性异常毒性等等无菌试无菌试 验验分分 装装当日分装完毕当日分装完毕大罐可二天大罐可二天质质 量量 标标 准：准：80年代年代 美国美国 FDA 10pg/剂剂 欧盟、

20、欧盟、WHO 100pg/剂剂 我国卫生部我国卫生部 100pg/剂剂 90年代后期年代后期 WHO 推荐为推荐为 10ng/剂剂 2000年版年版中国生物制品规程中国生物制品规程10 ng/剂剂 2005年版年版中国生物制品规程中国生物制品规程100 pg/剂剂 检测灵敏度：检测灵敏度：2004年年IABS大会的观点：大会的观点：肿瘤细胞的肿瘤细胞的DNA可以在动物模型或人类引起肿瘤的发生，经多个研究小组的定量风险可以在动物模型或人类引起肿瘤的发生，经多个研究小组的定量风险评并基于各种不同的设定为依据，得出的结论为：评并基于各种不同的设定为依据，得出的结论为：即使生物制品中存在细胞基质即使生

21、物制品中存在细胞基质DNA 的肿瘤风险是非常低的。的肿瘤风险是非常低的。中国药品生物制品检定所 2002年年5月月20日发表对以日发表对以Vero细细胞为基质的病毒性疫苗研制者的胞为基质的病毒性疫苗研制者的信。信。CBER的意见认为的意见认为Vero细胞作为细胞作为病毒性疫苗的培养用细胞基质是病毒性疫苗的培养用细胞基质是可以行的可以行的 http:/www.fda.gov/cber/ltr/vero031301.htm.Letter to Sponsors Using Vero Cells as a Cell Substrate for Investigational Vaccines FDA

22、美国美国FDA的的CBER对对Vero用于疫苗研制的建议用于疫苗研制的建议 Vero细胞生产的产品须无完整的细胞生产的产品须无完整的Vero细胞细胞 虽然虽然WHO目前已接受注射用传代细胞产品目前已接受注射用传代细胞产品DNA残余量不超过残余量不超过 10ng/剂。剂。CBER建议须继续关注产品中建议须继续关注产品中Vero细胞残余细胞残余DNA的量。的量。残余残余Vero细胞细胞DNA的风险水平应按不同情况不同处理，要考虑疫苗的风险水平应按不同情况不同处理，要考虑疫苗的给药方法，如注射、粘膜或其他途径。的给药方法，如注射、粘膜或其他途径。因此因此CBER建议：建议：要确定终产品中残余细胞要确

23、定终产品中残余细胞DNA的量和的量和DNA的大小，应该在疫苗终产品的大小，应该在疫苗终产品中描述每人用剂量中含残余中描述每人用剂量中含残余DNA的量。的量。由于使用了各种不同的处理方法（如由于使用了各种不同的处理方法（如DNA酶处理）细胞残余酶处理）细胞残余DNA的量的量和大小可进一步下降，要评价已加入的生产工艺或考虑要加入的和大小可进一步下降，要评价已加入的生产工艺或考虑要加入的生产生产工艺以其减少工艺以其减少DNADNA，应注意由于改变工艺而引起潜在的产品质量的影，应注意由于改变工艺而引起潜在的产品质量的影响（如免疫原性）响（如免疫原性）为何对为何对DNA表示担忧表示担忧 原因原因 1、细

24、胞可能含有、细胞可能含有 1)致肿瘤基因致肿瘤基因 2)整合在细胞基因中的病毒基因整合在细胞基因中的病毒基因 2、生产疫苗用的细胞基因会带入疫苗终产品中、生产疫苗用的细胞基因会带入疫苗终产品中 3、产品中的、产品中的DNA通过注射进入使用者体内导致的肿瘤病原体感染通过注射进入使用者体内导致的肿瘤病原体感染 结果结果 1、感染、感染 2、诱发肿瘤、诱发肿瘤 1）肿瘤基因的表达）肿瘤基因的表达 2）原癌基因的激活）原癌基因的激活 3）肿瘤抑制基因的关闭（失去功能）肿瘤抑制基因的关闭（失去功能）3、突变基因的插入、突变基因的插入 激活、抑制功能丧失、正负调节功能的破坏激活、抑制功能丧失、正负调节功能

25、的破坏 任何哺乳动物均存在原癌基因，尤其是染色体变异的细胞任何哺乳动物均存在原癌基因，尤其是染色体变异的细胞致癌的风险更大，也是目前关注致癌的风险更大，也是目前关注Vero细胞安全性的焦点。细胞安全性的焦点。将完整的原癌基因切割，可能使其丧失致癌性。将完整的原癌基因切割，可能使其丧失致癌性。P53 P53基因是位于基因是位于17p13.117p13.1上，上，P53P53的突变与许多癌症相关的突变与许多癌症相关 它由它由393393个氨基酸组成，核苷酸大于个氨基酸组成，核苷酸大于1200bp1200bp。乳腺癌基因乳腺癌基因(Breast Cancer Gene,BACA)(Breast Ca

26、ncer Gene,BACA)目前至少发现目前至少发现2 2个个 位于位于17q2117q21，BACA1BACA1，基因长度大于，基因长度大于100kb100kb 位于位于13q12.313q12.3，BACA2BACA2，基因长度大于，基因长度大于70kb70kb 白血病人白血病人9 9号染色体上的号染色体上的8.5kb8.5kb的的mRNAmRNA是突变基因。是突变基因。子宫颈癌病因子宫颈癌病因9595由人乳头瘤病毒所致，已知由人乳头瘤病毒所致，已知E7E7基因是重基因是重 要原因，要原因，E7E7基因由基因由300300多个核苷酸组成。多个核苷酸组成。检定项目检定项目 质量标准质量标准

27、 半成半成 品配品配 制前制前 原液原液残余牛血清蛋白含量残余牛血清蛋白含量 (ngng/剂剂)50 50抗原含量抗原含量 (血凝血凝,ELISA),ELISA)VeroVero细胞细胞DNADNA残留残留100 Pg/100 Pg/剂剂地鼠肾鸡胚细胞疫苗不作该项地鼠肾鸡胚细胞疫苗不作该项灭活试验灭活试验脑内注射小鼠脑内注射小鼠2020只，观察只，观察1414天，应全部健存天，应全部健存蛋白含量测定蛋白含量测定 120ug/120ug/剂剂 成品成品 检定检定鉴别试验鉴别试验同效力试验，效力试验不合格时，鉴别试验不成立同效力试验，效力试验不合格时，鉴别试验不成立外观外观因为白色疏松体，复溶因为

28、白色疏松体，复溶后后应为澄明液体，无异物应为澄明液体，无异物化学化学检定检定 PHPH值值7.2 8.07.2 8.0水份（水份（w/ww/w ）3.0%3.0%液体疫苗不作该项液体疫苗不作该项硫柳汞含量硫柳汞含量 (mg/ml)(mg/ml)0.10 0.10无菌试验无菌试验应无细菌生长应无细菌生长细菌内毒素细菌内毒素 100 EU 100 EU异常毒异常毒性试验性试验 小鼠法小鼠法小鼠应键在小鼠应键在,体重增加体重增加 豚鼠法豚鼠法豚鼠应键在豚鼠应键在,体重增加体重增加效力实验效力实验应应2.5IU/2.5IU/剂剂热稳定试验热稳定试验37 1437 14天后，效力试验应天后，效力试验应2

29、.5IU/2.5IU/剂剂一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、原代细胞培养疫苗、原代细胞培养疫苗 2、二倍体细胞培养疫苗、二倍体细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白、人白蛋白 2、抗生素、抗生素 3、明胶、明胶 4、牛血清、牛血清 5、防腐剂、防腐剂四、暴露后处理的失败案例四、暴露后处理的失败案例 人白蛋白是大多数疫苗中添加的保护剂，使疫苗的效力稳人白蛋白是大多数疫苗中添加的保护剂

30、，使疫苗的效力稳定，尤其是液体疫苗。定，尤其是液体疫苗。目前人白蛋白的生产工艺为目前人白蛋白的生产工艺为“低温乙醇法低温乙醇法”经不同浓度经不同浓度的乙醇反复沉淀所得，最终产品还须经的乙醇反复沉淀所得，最终产品还须经60 10小时的专项小时的专项病毒灭活。病毒灭活。经验证该产品有可靠的安全性，国内外至今尚无使用经验证该产品有可靠的安全性，国内外至今尚无使用该产品而感染该产品而感染HIV、HBV、HCV等报道。等报道。是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂，是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂，纯化过程中已基本去除，质量标准纯化过程中已基本去除，质量标准50 n g/剂剂 最担心疯牛病

31、（传染性海绵状脑病、最担心疯牛病（传染性海绵状脑病、T S E）WHO：人及动物传染性海绵状脑病相关的医用或人及动物传染性海绵状脑病相关的医用或 其他制品的研讨会报告（其他制品的研讨会报告（1997.3）Report of a WHO Consultation on Medicinal and Other Products in Relation to Human and Animal Transmissible Spongiform Encephalitis 无血清培养基生产的细胞培养疫苗正在研发中无血清培养基生产的细胞培养疫苗正在研发中 I 类类 高度感染高度感染 脑脊髓（脑脊髓（眼）眼）

32、II类类 中度感染中度感染 脾脏、扁逃体、淋巴结、回肠、近端大脾脏、扁逃体、淋巴结、回肠、近端大 肠、脑脊液、脑垂体、肾上腺、（硬脑肠、脑脊液、脑垂体、肾上腺、（硬脑 膜、松果体、胎盘）膜、松果体、胎盘）III类类 低感染性低感染性 周围神经、鼻黏膜、胸腺、骨髓、肝、周围神经、鼻黏膜、胸腺、骨髓、肝、肺、胰腺肺、胰腺 IV类类 无感染性无感染性 骨骼肌、心脏、乳腺、牛奶、血清、粪骨骼肌、心脏、乳腺、牛奶、血清、粪 便、肾脏、甲状腺、唾液腺、唾液、卵便、肾脏、甲状腺、唾液腺、唾液、卵 巢、子宫、睾丸、附睾、胎儿组织、初巢、子宫、睾丸、附睾、胎儿组织、初 乳、胆汁、骨骼、软骨组织、结缔组、乳、胆汁

33、、骨骼、软骨组织、结缔组、毛发、皮肤、尿液。毛发、皮肤、尿液。1、1980年年-1996年在英国居住满年在英国居住满3个月者个月者 2、1980年年-1990年在北欧的军事基地居住满年在北欧的军事基地居住满 3个月或在南欧满个月或在南欧满6个月以上。个月以上。3、1980年年-目前在法国居住满目前在法国居住满5年以上年以上 4、自、自1980年以来接受过输血的人员。年以来接受过输血的人员。5、自、自1980年年-目前在欧洲居住满目前在欧洲居住满5年以上者。年以上者。以上人员不能献全血，但可以献血浆，因为以上人员不能献全血，但可以献血浆，因为 白蛋白的制备过程能去掉海绵状脑病的致病白蛋白的制备过

34、程能去掉海绵状脑病的致病 因子；而英国、法国人两者均不能。因子；而英国、法国人两者均不能。Revised preventive measures to reduce the possible risk of transmission of Creutzfeldt-Jakob(CJD)Disease and Variant Creutzfeldt-Jakob Disease by blood and blood product,Final FDA guidance document,WWW.fda.gov/cber/gdlns/cjdvcjdq&a.htm 国际上趋势：疫苗中尽可能不用明胶国际上

35、趋势：疫苗中尽可能不用明胶 冻干疫苗中冻干保护剂使用明胶：冻干疫苗中冻干保护剂使用明胶：动物源性明胶动物源性明胶 猪源性明胶猪源性明胶 牛源性明胶牛源性明胶 牛皮源性明胶牛皮源性明胶 牛骨源性明胶牛骨源性明胶 绝不能使用头骨和脊髓骨绝不能使用头骨和脊髓骨 产生抗明胶产生抗明胶IgE抗体，出现较重且多的过敏反应抗体，出现较重且多的过敏反应 在疫苗的生产阶段，有些抗菌素可使用在疫苗的生产阶段，有些抗菌素可使用 如卡那酶素、新霉素等，在纯化过程中应尽可能去除。如卡那酶素、新霉素等，在纯化过程中应尽可能去除。但不能加青酶素和但不能加青酶素和-内酰胺类。内酰胺类。国外疫苗生产常用新霉素，而中国均使用卡那

36、霉素、国外疫苗生产常用新霉素，而中国均使用卡那霉素、庆大霉素。临床上新霉素常用于外用，而卡那霉素、庆大霉素。临床上新霉素常用于外用，而卡那霉素、庆大霉素常用于肌肉和静脉注射。庆大霉素常用于肌肉和静脉注射。疫苗中使用新霉素引起过敏反应的风险要小于卡那、疫苗中使用新霉素引起过敏反应的风险要小于卡那、庆大霉素庆大霉素 硫柳汞(无机汞）：常用浓度0.01%，易溶于水。作用：对革兰氏阳性、阴性的球菌、杆菌的抑菌能力均很强。原理：重金属离子与菌体中酶蛋白的巯基（-SH）结合使酶失去活性，硫 柳汞对菌体、病毒和血清蛋白的损害很弱。使用范围：目前我国的液体疫苗均添加硫柳汞作为防腐剂。其他防腐剂：氯仿、硝酸汞苯

37、、石炭酸等但疫苗一般不使用。趋势：不使用防腐剂，在完全达到GMP要求的100级条件下生产不应有细 菌生长，只有多人份分装时不能一次用毕的疫苗才加防腐剂。担忧：担忧：可能引起注射局部红肿等不良反应可能引起注射局部红肿等不良反应 可能对可能对6个月内婴儿产生体内蓄积（脑中）个月内婴儿产生体内蓄积（脑中）WHO意见：含硫柳汞疫苗的危险并未得到证实，没有任何理由需要担忧含硫意见：含硫柳汞疫苗的危险并未得到证实，没有任何理由需要担忧含硫 柳汞疫苗的安全性，因此也不必改变现有的免疫接种活动。柳汞疫苗的安全性，因此也不必改变现有的免疫接种活动。http:/www.who.int/vaccine_safety

38、/topics/thiomersal/questions/en/index.html 一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、二倍体细胞培养疫苗、二倍体细胞培养疫苗 2、原代细胞培养疫苗、原代细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白、人白蛋白 2、抗生素、抗生素 3、明胶、明胶 4、牛血清、牛血清 5、防腐剂、防腐剂四、暴露后处理的失败案例四、暴露后处理的失败案例 Henry Wilde，

39、Failures of post-exposure rabies Prophylaxis,Vaccine,2007(25):7605-760972岁泰国老妪,颈部被犬咬伤,伤口处理及时正确,并注射了法国产马抗血清,剩余部分注射三角肌,PVRV 0、3、7、14注射，14天时增加PCEC疫苗 第20天发病死亡。泰国9岁男孩被犬咬伤鼻子和颈部，伤口处理及时正确并浸润注射法国ERIG，剩余部分注射大腿肌肉；0、3、7、14天三角肌注射印度产PCEC疫苗，30天时发病死亡；泰国7岁男孩，被犬咬伤手臂、腿、躯干和背部，伤口处理及时，将法国产ERIG 按40IU/kg以1：1稀释后全部伤口注射，同时肌肉注

40、射Verorab，三天后按皮内法注射疫苗，第20天发病死亡；南非57岁男性，被猫鼬咬伤手指和手腕，伤口及时正确处理，包括次氯酸消毒，HIRG伤口注射，剩余部分三角肌注射，HDCV疫苗免疫，但14天发病出现症状，30天死于狂犬病；菲律宾4岁女孩，被犬咬裂肩部和背部，伤口处理正确及时，法国ERIG 1：2稀释注射全部伤口后等待数小时再缝合，Verorab疫苗免疫，第19天出现症状后死亡；南非4岁小男孩被犬咬伤左脸颊，伤口处理后150IU 的HRIG浸润注射，按公斤体重计算后所得的免疫球蛋白的剩余部分三角肌注射，法国产HDCV 0、3、7、14天肌注，第18天出现症状死亡；6岁菲律宾男孩，犬咬伤上唇

41、，伤口得以正确处理，第二天伤口注射法国Favirab，剩余部分注三角肌，PVRV皮内法0.1ml 2个点，第三天和第七天o.5ml全量三角肌注射，25天出现症状，29天死亡；南非19岁强壮军人，猫鼬咬伤手指后立即处理伤口，使用法国HRID 1ml伤口注射，按20IU/KG计算的剩余部分三角肌注射，HDCV 0、3、7、14天臀部肌肉注射，21天出现症状，28天注射最后一剂疫苗，第30天600ml高效价免疫血清静脉注射，第37天死亡。疫苗免疫失败的可能原因疫苗免疫失败的可能原因 上面报道的病例：上面报道的病例：进行伤口处理、免疫球蛋白和疫苗的及时正确注射。进行伤口处理、免疫球蛋白和疫苗的及时正确

42、注射。PEP失败的可能原因：失败的可能原因：1、不易观察到的微小穿透性致伤，可能导致伤口没有得到冲洗、消毒和注射免疫球蛋白。、不易观察到的微小穿透性致伤，可能导致伤口没有得到冲洗、消毒和注射免疫球蛋白。2、病人尚未被诊断出患有免疫功能下降性疾病或使用了免疫抑制性药物而没有报告。、病人尚未被诊断出患有免疫功能下降性疾病或使用了免疫抑制性药物而没有报告。3、手臂、手指和面部等神经组织分布丰富的部位被咬伤。、手臂、手指和面部等神经组织分布丰富的部位被咬伤。4、不同个体的白细胞、不同个体的白细胞A位点（位点（Human Leucocyte Locus A）所表现的基因型存在差异，）所表现的基因型存在差

43、异，HLA为为B7和和Dr2者接种狂犬病疫苗后产生抗体即早又高，而者接种狂犬病疫苗后产生抗体即早又高，而Dr3者抗体产生晚而且又低者抗体产生晚而且又低 结论：结论：这些病例的死亡提示，即使非常严密地作了这些病例的死亡提示，即使非常严密地作了PEPPEP也可能得不到也可能得不到100100的到保护。的到保护。小结小结 我国目前上市的狂犬病疫苗有三种，全部为细胞培养疫苗，分别我国目前上市的狂犬病疫苗有三种，全部为细胞培养疫苗，分别为原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞和为原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞和Vero传代细胞疫苗；传代细胞疫苗；三种疫苗的成品标准基本一样，但三种疫苗的成品标准基本一样，但Vero细胞培养疫苗需要控制和细胞培养疫苗需要控制和检测细胞检测细胞DNA；三种疫苗均存在优缺点，只要达到批准的标准，均安全有效，但三种疫苗均存在优缺点，只要达到批准的标准，均安全有效，但均在进一步改进；均在进一步改进；疫苗中的各种添加成分将进一步较少，或尽可能去除；疫苗中的各种添加成分将进一步较少，或尽可能去除；完整的完整的PEP仍有个别病例不能保护。仍有个别病例不能保护。.谢 谢