从动物肝组织中分离提取酶课件.ppt

1、从动物肝组织中分离提取酶 设计从动物肝组织中分离、提取、设计从动物肝组织中分离、提取、纯化、和鉴定一种酶（该酶由不同的纯化、和鉴定一种酶（该酶由不同的亚基组成，为结合酶，亚基组成，为结合酶，pI=6.2pI=6.2）的技）的技术路线，并说明试验各步骤的原理术路线，并说明试验各步骤的原理设计实验:2样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收 集第一个峰的蛋白溶液引发剂过硫酸铵（Ap），催化剂四甲基乙二胺（TEMED）SDS(十二烷基磺酸钠）能打断蛋白质的氢键和疏水 键，按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带

2、负电荷的量远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差 异。离子交换柱层析法分离纯化肝酶25%考马斯亮蓝R250 漂洗（10-20min）脱色）DEAE-纤维素为阴离子交换剂，在pH6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度离子交换柱层析法分离纯化肝酶沉降系数是为颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。动物肝脏酶的初步分离提取防止蛋白酶的水解作用：离心，去上清，留沉淀得出一条带则说明分离的蛋白质纯度较高装柱与平衡（乙酸铵溶液）离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离各种离子的层析技术。离子交换柱层析法分离纯化肝酶待测蛋白质样品的制备（加入4*

3、缓冲液）配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀 硫酸或氨水调PH到6.样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐 标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第二个峰的酶溶液 即为PI=6.离子交换柱层析法分离纯化肝酶动物肝酶的初步分离提取设计从动物肝组织中分离、提取、纯化、和鉴定一种酶（该酶由不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶 的溶液SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制结合酶：分蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)和辅助因子(cofactor)，辅助因子中含金属离子、小分子化合物样品上样、用乙酸铵缓

4、冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐 标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第二个峰的酶溶液 即为PI=6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀 硫酸或氨水调PH到6.（但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。亚基：亚基：组成蛋白质四级结构最小的共价单位，是指四级组成蛋白质四级结构最小的共价单位，是指四级结构的蛋白质中具有三级结构的球蛋白结构的蛋白质中具有三级结构的球蛋白 结合酶：结合酶：分蛋白质部分：酶蛋白分蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)(apoenzyme)和辅助因和辅助因子子(cofactor)(cofactor)，辅助因子中含金属离子

5、、小分子化合物，辅助因子中含金属离子、小分子化合物 PI：等电点：在某一等电点：在某一pHpH的溶液中，氨基酸解离成阳离子的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的此时溶液的pHpH称为该氨基酸的等电点。称为该氨基酸的等电点。3实验流程：实验流程：1.取动物肝组织取动物肝组织2.对肝组织进行预处理对肝组织进行预处理3.动物肝酶的初步分离提取动物肝酶的初步分离提取4.离子交换柱层析法分离纯化肝酶离子交换柱层析法分离纯化肝酶5.肝酶活性检验肝酶活性检验6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度聚丙烯

6、凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度41.取动物肝组织取动物肝组织 材料选择：选取新鲜的，饥饿材料选择：选取新鲜的，饥饿24小时的小时的动物的肝脏，生理盐水冲洗动物的肝脏，生理盐水冲洗2.对肝组织进行预处理对肝组织进行预处理 在冰块中用小剪剪碎肝脏，移入插在冰在冰块中用小剪剪碎肝脏，移入插在冰块中洗净的匀浆器中进行匀浆块中洗净的匀浆器中进行匀浆 分次加入分次加入0.25mol/L冰冷蔗糖冰冷蔗糖10ml，匀，匀浆液经浆液经32层纱布（或双层尼龙织物）过层纱布（或双层尼龙织物）过滤，得匀浆液滤，得匀浆液56防止蛋白酶的水解作用：防止蛋白酶的水解作用：预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝预防的措施是加入蛋白

7、酶抑制剂。常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSFPMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTAEDTA和和EGTAEGTA（乙二醇四乙酸）（乙二醇四乙酸）除核酸：除核酸：一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%2%1%2%的链霉素硫酸盐、的链霉素硫酸盐、PEGPEG、溶菌酶等。、溶菌酶等。梯度离心获得含有酶的细胞液梯度离心获

8、得含有酶的细胞液原理：原理：l离心基本原理是根据离心基本原理是根据物质沉降系数、质量、物质沉降系数、质量、浮力因子浮力因子等不同，利用离心机产生的强大等不同，利用离心机产生的强大离心力来分离具有不同沉降系数的物质。离心力来分离具有不同沉降系数的物质。沉降系数是为颗粒在离心力场的作用下，沉降系数是为颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用其单位用S S表示，反映的是单位离心力作用表示，反映的是单位离心力作用下颗粒沉降的速度。下颗粒沉降的速度。7离心管中加入离心管中加入5ml 0.34M蔗糖，将蔗糖，将5ml匀浆轻匀浆轻轻覆在轻覆在

9、其上，其上，1600r/min离心离心10min，得上清，得上清液（液（1）沉淀加沉淀加10ml 0.25M蔗糖混匀，蔗糖混匀，3500r/min离心离心10min，得上清液（得上清液（2）将上清液（将上清液（1）（）（2）混合取）混合取1ml,6600r/min离心离心 10min，得上清液，即为酶体和微粒体，得上清液，即为酶体和微粒体 实验步骤：实验步骤：梯度离心获得含有酶的细胞液梯度离心获得含有酶的细胞液8实验流程：实验流程：1.取动物肝组织取动物肝组织2.制作组织浆液制作组织浆液3.动物肝酶的初步分离提取动物肝酶的初步分离提取4.离子交换柱层析法分离纯化肝酶离子交换柱层析法分离纯化肝酶

10、5.肝酶活性检验肝酶活性检验6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度93.动物肝脏酶的初步分离提取动物肝脏酶的初步分离提取l中性盐类能破坏溶液中蛋白分子中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面电荷表面电荷和和水化膜水化膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。（但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓析出。（但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。例如，度不同。例如，50饱和的饱和的硫酸铵硫酸铵能使血清能使血清中的球蛋白沉淀，而中的球蛋白沉淀，而33饱和的硫酸铵则使饱和的硫酸铵则使-球蛋白沉淀。）因此，可根据所要分离的球蛋白沉淀。）因此，可根据所要分离的蛋

11、白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。盐析。原理：原理：10 配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀值并用稀 硫酸或氨水调硫酸或氨水调PH到到6.2 将酶溶液与硫酸铵溶液混合，静止一段将酶溶液与硫酸铵溶液混合，静止一段时间时间 离心，去上清，留沉淀离心，去上清，留沉淀 加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析袋中加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶透析，得含酶 的溶液的溶液实验步骤：实验步骤：3.动物肝脏酶的初步分离提取动物肝脏酶的初步分离提取11实验流程：实验流程：1.取动物肝组织取动物肝组织2.制作组织浆液制作组织

12、浆液3.动物肝酶的初步分离提取动物肝酶的初步分离提取4.离子交换柱层析法分离纯化肝酶离子交换柱层析法分离纯化肝酶5.肝酶活性检验肝酶活性检验6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度124.离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶l离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子有不同离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子有不同的的亲和力亲和力，来分离各种离子的层析技术。，来分离各种离子的层析技术。l不同不同离子化合物带电荷多少不同离子化合物带电荷多少不同，与离子交换剂作，与离子交换剂作用和强弱不同，当它们结合到固定相交换基团上以后，用和强弱不同，当它们

13、结合到固定相交换基团上以后，可以用提高流动相中可以用提高流动相中离子强度或改变离子强度或改变pH的办法，把它的办法，把它们从离子交换剂上依次洗脱下来，达到分离纯化的目们从离子交换剂上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。的。lDEAE-纤维素为阴离子交换剂，在纤维素为阴离子交换剂，在pH6.1条件下，条件下，带有带有正电荷，能够吸附带负电荷得物质正电荷，能够吸附带负电荷得物质，而，而pI为为6.2的酶不的酶不与纤维素结合，因而留在溶液中，此时收集所得即为与纤维素结合，因而留在溶液中，此时收集所得即为肝酶。肝酶。原理：原理：134.离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶14DE

14、AE-纤维素处理为纤维素处理为PH值为值为6.1（Hcl）装柱与平衡（乙酸铵溶液）装柱与平衡（乙酸铵溶液）样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或三氯乙酸或磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收 集第一个峰的蛋白集第一个峰的蛋白溶液溶液 处理处理DEAE-纤维素溶液为纤维素溶液为PH=6.3 装柱与平衡（乙酸铵溶液）装柱与平衡（乙酸铵溶液）样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐量为纵坐 标

15、，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第二个峰的酶溶液收集第二个峰的酶溶液 即为即为PI=6.2左右的蛋白质溶液左右的蛋白质溶液 实验步骤：实验步骤：4.离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶15实验流程：实验流程：1.取动物肝组织取动物肝组织2.制作组织浆液制作组织浆液3.动物肝酶的初步分离提取动物肝酶的初步分离提取4.离子交换柱层析法分离纯化肝酶离子交换柱层析法分离纯化肝酶5.肝酶活性检验肝酶活性检验6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度165.肝酶活性检验肝酶活性检验原理：原理：l结合酶的辅助

16、因子按其与酶蛋白结合的紧结合酶的辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度密程度 不同分为辅基和辅酶，辅基与酶蛋不同分为辅基和辅酶，辅基与酶蛋白共价键紧密结合，白共价键紧密结合，透析、超滤等物理方透析、超滤等物理方法不能除掉，辅酶与酶蛋白非共价法不能除掉，辅酶与酶蛋白非共价 结合，结合，较为疏松，透析和超滤等方法可以分离。较为疏松，透析和超滤等方法可以分离。l本实验中获得的肝脏中的酶为三个亚基的本实验中获得的肝脏中的酶为三个亚基的结合酶，需要进行活性检验。结合酶，需要进行活性检验。17若结合酶含有辅基，则直接加入底物，根据生若结合酶含有辅基，则直接加入底物，根据生成物的性质进行生成物的鉴定成物的性质进

17、行生成物的鉴定 若结合酶含有辅酶，则加入辅助因子（小分子若结合酶含有辅酶，则加入辅助因子（小分子有机化有机化 合物和金属离子）然后再加入底物鉴定合物和金属离子）然后再加入底物鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶的分离纯度聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶的分离纯度 实验步骤：实验步骤：5.肝酶活性检验肝酶活性检验18需要注意的是，在进行完前面的每一个步骤后最好都进行一需要注意的是，在进行完前面的每一个步骤后最好都进行一次活性检验，这样可以及时发现问题，减少后续的不必要的次活性检验，这样可以及时发现问题，减少后续的不必要的工作。工作。实验流程：实验流程：1.取动物肝组织取动物肝组织2.制作组织浆液制作组

18、织浆液3.动物肝酶的初步分离提取动物肝酶的初步分离提取4.离子交换柱层析法分离纯化肝酶离子交换柱层析法分离纯化肝酶5.肝酶活性检验肝酶活性检验6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度196.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度纯度 Acr(丙烯酰胺丙烯酰胺)+Bis(交联剂交联剂N)网状结构凝胶网状结构凝胶 引发剂过硫酸铵（引发剂过硫酸铵（Ap），催化剂四甲基乙二胺（），催化剂四甲基乙二胺（TEMED）SDS(十二烷基磺酸钠）能打断蛋白质的十二烷基磺酸钠）能打断蛋白质的氢键氢键和和疏水疏水 键键，按一，按一定的比例和蛋白质分子结合成复

19、合物，使蛋白质带负电荷的定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的量远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差电荷差 异。异。SDS-PAGE常用来检测蛋白质样品的纯化程度，常用来检测蛋白质样品的纯化程度，如果被如果被 鉴定的蛋白质很纯，只含有一种三级结构的蛋白质或鉴定的蛋白质很纯，只含有一种三级结构的蛋白质或含含 有相同分子量亚基的具有四级结构的蛋白质，那么有相同分子量亚基的具有四级结构的蛋白质，那么SDS-PAGE后就只出现一条蛋白质区带。后就只出现一条蛋白质区带。原理：原理：20 不连续凝胶电泳的支持体由不连续凝

20、胶电泳的支持体由分离胶分离胶和和浓缩胶浓缩胶组成。上组成。上 层为浓层为浓缩胶，下层为分离胶，两层中缩胶，下层为分离胶，两层中Acr（丙烯酰胺）（丙烯酰胺）浓度不同，浓度不同，孔径大小就不同，带电荷蛋白质离子在浓缩孔径大小就不同，带电荷蛋白质离子在浓缩 胶中泳动时，因胶中泳动时，因受阻力小，泳动速度较快。当泳动到小受阻力小，泳动速度较快。当泳动到小 孔径分离胶时，遇到孔径分离胶时，遇到阻力大，移动速度逐渐减慢，使样阻力大，移动速度逐渐减慢，使样 品品浓缩成很窄的区带浓缩成很窄的区带。原理：原理：6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度纯度分离胶的孔径有一定大小，对不

21、分离胶的孔径有一定大小，对不同相对分子质量的蛋同相对分子质量的蛋 白质来说，白质来说，通过时受到的阻滞不同，即使静通过时受到的阻滞不同，即使静电荷相等的颗粒也会由于此电荷相等的颗粒也会由于此分子分子筛的作用，将不同大小的蛋白质筛的作用，将不同大小的蛋白质分开分开。21待测蛋白质样品的制备（加入待测蛋白质样品的制备（加入4*缓冲液）缓冲液）垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制 加样（酶溶液）加样（酶溶液）电泳（浓缩胶电泳（浓缩胶80V 分离胶分离胶150V）剥胶剥胶 染色和褪色（染色和褪色（0.25%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250 漂洗漂洗（10-20min）脱色）脱色）得出一条带则说明分离的蛋白质纯度较高得出一条带则说明分离的蛋白质纯度较高 实验步骤：实验步骤：6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度纯度22