免疫原和抗血清的制备课件.ppt

1、第三章第三章 免疫原和抗血清的制备免疫原和抗血清的制备第1页，共38页。第一节第一节 免疫原的制备免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备三、半抗原性免疫原的制备第二节第二节 免疫佐剂免疫佐剂 一、佐剂的种类一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制二、佐剂的作用机制第三节第三节 抗血清的制备抗血清的制备 一、免疫动物的选择一、免疫动物的选择 二、免疫程序二、免疫程序 三、动物采血法三、动物采血法第2页，共38页。第四节第四节 抗血清的鉴定和保存抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定一、抗血清的鉴定 二、抗血清

2、的保存二、抗血清的保存第五节第五节 抗血清的纯化抗血清的纯化 一、特异性一、特异性IgGIgG抗体抗体 二、单价特异性抗血清二、单价特异性抗血清思考题思考题小结小结第3页，共38页。第一节第一节 免疫原的制备免疫原的制备 免疫原免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体并是能诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质能与抗体发生反应的物质颗粒性抗原颗粒性抗原细胞、细菌、寄生虫细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原可溶性抗原蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸第4页，共38页。细胞抗原：绵羊红细胞细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫

3、体抗原：虫卵寄生虫体抗原：虫卵一、颗粒性抗原的制备一、颗粒性抗原的制备第5页，共38页。组织细胞抗原的制备：组织细胞抗原的制备：高速捣碎法组织捣碎机捣碎高速捣碎法组织捣碎机捣碎 研磨法用玻璃匀浆器或乳钵研磨研磨法用玻璃匀浆器或乳钵研磨（一）可溶性抗原的制备（一）可溶性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化二、可溶性抗原的制备和纯化第6页，共38页。组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备：组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备：反复冻融法反复冻融法-20冻结，然后室温融化冻结，然后室温融化 超声破碎法超声波（超声破碎法超声波（120kHz）自溶法自身酶系自溶法自身酶系 酶处理法溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶酶处

4、理法溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 表面活性剂处理法表面活性剂处理法SDS、去氧胆酸钠、二、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴乙基十六烷基溴 第7页，共38页。免疫球蛋白片段的制备：免疫球蛋白片段的制备：非共价键解离法改变非共价键解离法改变pH pH、利用强变性剂、利用强变性剂 共价键解离法氧化法和还原法共价键解离法氧化法和还原法 溴化氰裂解法溴化氰裂解法 酶解法木瓜酶酶解法木瓜酶 、胃蛋白酶、胃蛋白酶 第8页，共38页。超速离心法：超速离心法：差速离心法低速和高速离心交替进行差速离心法低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法区带离心法密度梯度离心法区带离心法 （二）可溶性抗原的纯化（二）可溶性抗原的纯化第

5、9页，共38页。选择性沉淀法：选择性沉淀法：核酸去除法氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉核酸去除法氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素素 盐析法硫酸铵、硫酸钠盐析法硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法乙醇、丙酮有机溶剂沉淀法乙醇、丙酮 聚合物沉淀法聚乙二醇聚合物沉淀法聚乙二醇 第10页，共38页。离子交换层析法：离子交换层析法：利用蛋白质带电荷不同进行分离利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂：离子交换剂：离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂 凝胶过滤法：凝胶过滤法：利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离进行分离 第

6、11页，共38页。亲和层析法：亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 (1)(1)亲和层析支持物的选择：亲和层析支持物的选择：非特异性吸附低；非特异性吸附低；液体流速快；液体流速快；在各种在各种pHpH和高浓度盐溶液中稳定；和高浓度盐溶液中稳定；有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结 合；合；有丰富的微孔，以增加结合容量。有丰富的微孔，以增加结合容量。最常用的支持物是最常用的支持物是Separose4BSeparose4B 第12页，共38页。(2)(2)配体的选择配体的选择条件：条件：抗原或抗体必

7、须单一特异性；抗原或抗体必须单一特异性；抗原与抗体必须具有较高的亲和力；抗原与抗体必须具有较高的亲和力；配体必须有一个适当的化学基团。配体必须有一个适当的化学基团。第13页，共38页。(3)(3)抗原或抗体与支持物的结合：抗原或抗体与支持物的结合：活化：溴化氰；活化：溴化氰；接接“手臂手臂”：带：带“手臂手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖有氨基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、重琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。第14页，共38页。(4)(4)亲和层析条件的选择：亲和层析条件的选择：封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺过柱；封闭活性基团：用无

8、关蛋白质或三乙醇胺过柱；除去未结合和结合不牢的蛋白：先用除去未结合和结合不牢的蛋白：先用NaHCONaHCO3 3洗脱，洗脱，再用解脱剂处理；再用解脱剂处理；解脱剂：解脱剂：3mol/L 3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、硫氰酸钾（或钠）、0.1mol/L 0.1mol/L pH2.4pH2.4甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液第15页，共38页。电泳法：电泳法：利用分子量和电荷量不同进行分离利用分子量和电荷量不同进行分离 第16页，共38页。（三）纯化抗原的鉴定（三）纯化抗原的鉴定蛋白含量测定：蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：分子量测定：SDS-PA

9、GESDS-PAGE、凝胶过滤、凝胶过滤纯度鉴定：纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGESDS-PAGE、毛细管电泳、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、双向免疫扩散、免疫电泳、ELISAELISA第17页，共38页。三、半抗原性免疫原的制备三、半抗原性免疫原的制备 半抗原半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等 载体载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质赋予半抗原以免疫原性的物质第1

10、8页，共38页。蛋白质：蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白 牛甲状腺球蛋白牛甲状腺球蛋白 血蓝蛋白血蓝蛋白多肽聚合物：多肽聚合物：多聚赖氨酸多聚赖氨酸（polylysine）大分子聚合物：大分子聚合物：羧甲基纤维素羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）（一）载体（一）载体第19页，共38页。物理方法：物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原利用通过电荷和微孔吸附半抗原 吸附的载体有吸附的载体有CMCCMC、PVPPVP、硫酸葡聚糖

11、等、硫酸葡聚糖等（二）半抗原与载体的连接方法（二）半抗原与载体的连接方法化学方法：化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上利用某些功能基团将半抗原连接到载体上 带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法 戊二醛法戊二醛法 混和酸酐法混和酸酐法 过碘酸氧化法过碘酸氧化法 不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧基的不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，再与载体连接衍生物，再与载体连接 第20页，共38页。（三）半抗原性免疫原的鉴定（三）半抗原性免疫原的鉴定一个载体

12、分子至少要连接一个载体分子至少要连接2020个以上的半抗原分子个以上的半抗原分子 半抗原与载体的比例测定：半抗原与载体的比例测定：吸收光谱分析法吸收光谱分析法放射性核素标记半抗原渗入法放射性核素标记半抗原渗入法第21页，共38页。第二节第二节 免疫佐剂免疫佐剂免疫佐剂免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂剂,简称佐剂简称佐剂（adjuvant）。）。第22页，共38页。化合物化合物:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温

13、氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80-80、弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚、弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸肌苷酸 胞苷酸胞苷酸(poly I C)、脂质体脂质体 生物制剂生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及菌及CTBCTB、LPSLPS和类脂和类脂A A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白 用于人体的佐剂：用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、氢氧化铝、明矾、poly ICpoly IC、胞壁酰二肽、细胞因子、热、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白休克蛋白常用于动物

14、实验的佐剂：常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂弗氏佐剂(Freunds adjuvant)一、佐剂的种类一、佐剂的种类 第23页，共38页。弗氏佐剂弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)：弗氏完全佐剂羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏完全佐剂羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂加卡介苗弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂加卡介苗乳化方法：乳化方法：研磨法和搅拌混合法研磨法和搅拌混合法 第24页，共38页。改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。统。刺激单核刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。吞噬细胞系统，增强

15、其处理和提呈抗原的能力。刺激淋巴细胞增殖和分化。刺激淋巴细胞增殖和分化。二、佐剂的作用机制二、佐剂的作用机制第25页，共38页。第三节第三节 抗血清的制备抗血清的制备 抗血清的制备是将制备好的免疫原按照抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个多个B B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体 第26页，共38页。多克隆抗体的产生示意图多克隆抗体

16、的产生示意图多克隆抗体多克隆抗体(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗天然抗原刺激多种原刺激多种B B淋巴细胞克淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合隆产生的多种抗体的混合物物 第27页，共38页。抗原来源与动物种属的关系抗原来源与动物种属的关系 种属差异越远，免疫原性越强种属差异越远，免疫原性越强 动物个体的选择动物个体的选择 适龄、健康、体重符合要求适龄、健康、体重符合要求 抗原的性质抗原的性质一、免疫动物的选择一、免疫动物的选择第28页，共38页。免疫原的剂量免疫原的剂量 中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 免疫间

17、隔时间免疫间隔时间 第一次和第二次间隔第一次和第二次间隔10102020天，三次及以后间隔天，三次及以后间隔7 71010天天免疫途径免疫途径 皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结 二、免疫程序二、免疫程序第29页，共38页。颈动脉采血法：颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊家兔、绵羊、山羊 心脏采血法：心脏采血法：家兔、豚鼠、大鼠、鸡家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法：静脉采血法：家兔、山羊、绵羊家兔、山羊、绵羊 三、动物采血法三、动物采血法第30页，共38页。第四节第四节 抗血清的鉴定和保存抗血清的鉴定和保存第31页，共38页。抗体特异性的鉴定：抗体特异性的鉴定

18、：双向免疫扩散法双向免疫扩散法抗体效价的鉴定：抗体效价的鉴定：凝集试验凝集试验 、双向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、ELISA ELISA 抗体纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE SDS-PAGE、双向免疫扩散试验、免疫电泳、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲合力的鉴定：抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、平衡透析法、ELISAELISA、RIARIA竞争结合试验竞争结合试验 一、抗血清的鉴定一、抗血清的鉴定第32页，共38页。2288保存：短期保存保存：短期保存冰冻保存：保存冰冻保存：保存5 5年年真空干燥保存：保存真空干燥保存：保存5 51010年年二、抗血清的保存二、抗血清的保存第

19、33页，共38页。第五节第五节 抗血清的纯化抗血清的纯化 抗原免疫动物制备的抗血清是成分复抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。杂抗体干扰试验结果。第34页，共38页。盐析法：盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：凝胶过滤法：常结合盐析法常结合盐析法 离子交换层析法：离子交换层析法：DEAE纤维素、纤维素、QAE-sephadex、

20、QAE纤维纤维素素 亲和层析法：亲和层析法：纯化抗原或纯化抗原或SPA交联交联Sepharose 4B制成亲和制成亲和层析柱层析柱 一、特异性一、特异性IgG抗体抗体第35页，共38页。亲和层析法：亲和层析法：杂抗原交联杂抗原交联Sepharose 4B柱柱吸附剂方法：吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗借助双功能试剂用不含特异抗原的抗 原混合液制成固相吸附剂原混合液制成固相吸附剂二、单价特异性抗血清二、单价特异性抗血清第36页，共38页。1 1什么是免疫原？什么是免疫原？2 2如何制备可溶性抗原？如何制备可溶性抗原？3 3常用的细胞破碎方法有哪些？常用的细胞破碎方法有哪些？4 4连接

21、半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方法有哪些？法有哪些？5 5纯化抗原的鉴定包括有哪些内容？纯化抗原的鉴定包括有哪些内容？6 6什么是免疫佐剂？免疫佐剂有哪些种类？免疫佐剂的什么是免疫佐剂？免疫佐剂有哪些种类？免疫佐剂的作用机制有哪些？作用机制有哪些？7 7什么是抗血清？什么是多克隆抗体？什么是抗血清？什么是多克隆抗体？8 8如何制备抗血清？如何制备抗血清？9 9动物采血有哪些方法？动物采血有哪些方法？1010抗血清的鉴定包括哪些内容？抗血清的鉴定包括哪些内容？思考题思考题第37页，共38页。小小 结结 免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生

22、反应免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质，的物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质，与载体结合后可具有免疫原性。与载体结合后可具有免疫原性。免疫佐剂是先于抗原或与抗原一起注入机体，可免疫佐剂是先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质。类型的物质。抗血清是经过抗原免疫的动物血清。在含有多种抗血清是经过抗原免疫的动物血清。在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个抗原表位的抗原刺激下，体内多个B B细胞克隆被激活细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆并产生针对多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。抗体。特异性特异性IgGIgG抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等；制备单价特异法、离子交换层析法、亲和层析法等；制备单价特异性抗血清可采用亲和层析法和吸附剂方法。性抗血清可采用亲和层析法和吸附剂方法。第38页，共38页。