各类化学成分分析1..课件.ppt

1、第六章第六章各类化学成分分析各类化学成分分析第1页，共80页。讲授内容讲授内容 第第1节节 生物碱类成分分析生物碱类成分分析 第第2节节 黄酮类成分分析黄酮类成分分析 第第3节节 三萜皂苷类成分分析三萜皂苷类成分分析 第第4节节 醌类成分分析醌类成分分析 第第5节节 挥发性成分分析挥发性成分分析 第第6节节 木脂素类成分分析木脂素类成分分析 第第7节节 其它类型成分分析其它类型成分分析第2页，共80页。第一节第一节 生物碱类成分分析生物碱类成分分析 概述概述 理化性质理化性质 鉴别鉴别 含量测定含量测定第3页，共80页。一、概述一、概述 生物碱生物碱是生物界是生物界除除生物体必需的含氮化合生物

2、体必需的含氮化合物（如氨基酸、蛋白质和物（如氨基酸、蛋白质和B族维生素等）之族维生素等）之外的所有含氮有机化合物，因其结构中氮外的所有含氮有机化合物，因其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。原子上的未共享电子对而大多具有碱性。含生物碱成分的含生物碱成分的常用中药常用中药：山豆根、制川：山豆根、制川乌、马钱子、延胡索、苦参、麻黄、黄连、乌、马钱子、延胡索、苦参、麻黄、黄连、黄柏、防己等黄柏、防己等第4页，共80页。NOOOOBerberine小檗碱小檗碱HCCHCH3OHNHCH3Ephedrine hydrochlorede麻黄碱麻黄碱HOOCH3H3COOHOCCH3OC2H5NOH

3、OOCH3COAconitine乌头碱乌头碱NOO水苏碱水苏碱第5页，共80页。二、理化性质二、理化性质 物理性状物理性状 溶解性溶解性 紫外光谱特征紫外光谱特征 显色反应显色反应第6页，共80页。物理性状物理性状u液体状的生物碱及个别小分子生物碱有挥发性甚至液体状的生物碱及个别小分子生物碱有挥发性甚至升华性升华性 如：麻黄碱具有挥发性如：麻黄碱具有挥发性 咖啡因具有升华性咖啡因具有升华性u 生物碱通常无色，但有长共轭结构，并有助色生物碱通常无色，但有长共轭结构，并有助色团的，可显不同颜色。如：小檗碱黄色团的，可显不同颜色。如：小檗碱黄色第7页，共80页。溶解性溶解性 大多数生物碱难溶于水，易

4、溶于氯仿、大多数生物碱难溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂 与酸结合成盐生水溶性增加，但酸不同，与酸结合成盐生水溶性增加，但酸不同，生成的盐水溶性有差异生成的盐水溶性有差异 季胺型生物碱、有氮氧配位键的生物碱季胺型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水。易溶于水。第8页，共80页。溶解性溶解性 液体生物碱及一些小分子固体生物液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于有机溶剂碱则既溶于水也可溶于有机溶剂 含有酸性官能团或酯键的生物碱还含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液可溶于一些碱液或热苛性碱液第9页，共80页。显色反应显色

5、反应 生物碱在一定生物碱在一定pH条件下与一些酸性染料条件下与一些酸性染料（多为磺酸肽类）生成有色配合物，可（多为磺酸肽类）生成有色配合物，可被氯仿等有机溶剂定量提出。被氯仿等有机溶剂定量提出。结构中具有酯键的酯碱，如：乌头碱可结构中具有酯键的酯碱，如：乌头碱可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色第10页，共80页。紫外光谱特征紫外光谱特征 结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外吸收。吸收。结构中的氮原子与发色团直接连接或参结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生物碱，其吸收峰位置与测与发色团的生物碱，其吸收峰位置与测定时溶剂的定时溶

6、剂的pH值有关。值有关。第11页，共80页。三、鉴别三、鉴别沉淀法沉淀法薄层色谱法薄层色谱法气相色谱法气相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法一般理化鉴别一般理化鉴别色谱鉴别色谱鉴别第12页，共80页。1、沉淀反应、沉淀反应大多数生物碱在酸性水溶液可与某些试剂生成不溶于水的复盐或大多数生物碱在酸性水溶液可与某些试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物。分子复合物。酸性酸性aq：KI-I2(棕红棕红)；BiI3KI(橘红黄橘红黄)；HgI22KI(类白类白)；硫硫氰酸铬铵氰酸铬铵(雷氏铵盐雷氏铵盐NH4Cr(NH3)2(SCN)4(红红)中性：苦味酸中性：苦味酸(三硝基苯酚三硝基苯酚)(黄黄)中药水浸液

7、中蛋白质、多肽和鞣质等成分，也可与生物碱沉淀中药水浸液中蛋白质、多肽和鞣质等成分，也可与生物碱沉淀试剂生成沉淀，需排除干扰，防止出现假阳性结果。试剂生成沉淀，需排除干扰，防止出现假阳性结果。季铵盐季铵盐剂剂第13页，共80页。2薄层色谱法薄层色谱法 吸附剂吸附剂：硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝 展开剂展开剂：多用：多用氯仿氯仿、苯苯等低极性溶剂，加入等低极性溶剂，加入其它溶剂调整其它溶剂调整展开剂的展开剂的极性极性。（由于硅胶显弱酸性，强碱性的生物碱在。（由于硅胶显弱酸性，强碱性的生物碱在硅胶板上能形成盐，使硅胶板上能形成盐，使Rf值很小或拖尾，形成复斑。在值很小或拖尾，形成复斑。在硅硅胶吸附胶吸附

8、薄层中，常用薄层中，常用碱性系统碱性系统或在或在碱性环境碱性环境下展开。）下展开。）显色剂：显色剂：改良碘化铋钾试剂改良碘化铋钾试剂，有时喷碘化铋钾试剂后再，有时喷碘化铋钾试剂后再喷硝酸钠试剂，可使样品斑点更清晰；亦可用碘蒸气、硫喷硝酸钠试剂，可使样品斑点更清晰；亦可用碘蒸气、硫酸铈、碘铂酸等。酸铈、碘铂酸等。第14页，共80页。例：三妙丸中黄柏及小檗碱的鉴别例：三妙丸中黄柏及小檗碱的鉴别(苍术、黄柏、牛膝苍术、黄柏、牛膝)取三妙丸粉末取三妙丸粉末0.1g,加加乙醚乙醚10ml，超声处理，超声处理15分钟，滤过，弃去乙醚分钟，滤过，弃去乙醚液，残渣加液，残渣加甲醇甲醇5ml，超声处理，超声处理

9、15分钟，滤过，滤液浓缩至分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1g，同制成对照药材溶液。再取，同制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含含0.5mg的溶液，作为对照品的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液溶液。吸取供试品溶液2m ml、对照药材溶液与对照品溶液各、对照药材溶液与对照品溶液各1m ml，分别，分别点于同一硅胶点于同一硅胶G薄层板上，以薄层板上，以苯苯-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-异丙醇异丙醇-浓氨试剂浓氨试剂(12 6 3 3 1)为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，

10、展开，为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，取出，晾干，置紫外灯置紫外灯(365nm)检视，供试品色谱中，检视，供试品色谱中，在与对照药材在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点；在与对照品色谱相色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的一个黄色荧光斑点。应的位置上，显相同的一个黄色荧光斑点。第15页，共80页。2纸色谱法纸色谱法 可用于可用于生物碱盐或游离碱生物碱盐或游离碱的鉴别。的鉴别。主要是以水为固定相的主要是以水为固定相的正相正相纸色谱法，分纸色谱法，分离效果常取决离效果常取决 于流动相的性质。于流动相的性质。BAW系统系统

11、显色剂：基本和薄层色谱法相同，但含硫显色剂：基本和薄层色谱法相同，但含硫酸的试剂不适用。酸的试剂不适用。第16页，共80页。3高效液相色谱法高效液相色谱法 依据：依据：tR 条件不同时，可已知品作内标，条件不同时，可已知品作内标，采用峰面积或峰高加大法采用峰面积或峰高加大法 优点：快速，灵敏、微量等优点：快速，灵敏、微量等第17页，共80页。四、含量测定四、含量测定 生物碱的含量测定方法早期常用生物碱的含量测定方法早期常用酸碱滴定酸碱滴定法、沉淀滴定法法、沉淀滴定法等经典的化学方法，近年等经典的化学方法，近年来多采用来多采用分光光度法、薄层色谱法及高效分光光度法、薄层色谱法及高效液相色谱法液相

12、色谱法等等（一）总生物碱的含量测定（一）总生物碱的含量测定（二）生物碱类单体成分的含量测定（二）生物碱类单体成分的含量测定第18页，共80页。（一）总生物碱的含量测定（一）总生物碱的含量测定直接测定法直接测定法重量分析法重量分析法酸碱滴定法酸碱滴定法离子对萃取比色法离子对萃取比色法酸染料比色法酸染料比色法苦味酸盐比色法苦味酸盐比色法雷氏盐比色法雷氏盐比色法异羟肟酸铁比色法异羟肟酸铁比色法化学分析法化学分析法分光光度法分光光度法本法适用于处方药味较少、内本法适用于处方药味较少、内成分较简单的中药制剂成分较简单的中药制剂第19页，共80页。酸碱滴定分析法酸碱滴定分析法u强碱滴定生物碱强碱滴定生物碱

13、盐盐时，在时，在7090的乙的乙醇介质中终点比在水中明显，因此常将生醇介质中终点比在水中明显，因此常将生物碱盐溶于物碱盐溶于70 90乙醇，再用标准碱乙醇，再用标准碱-乙醇液滴定。乙醇液滴定。u若选择的溶剂及指示终点方法合适，也可若选择的溶剂及指示终点方法合适，也可用非水滴定法进行。用非水滴定法进行。第20页，共80页。酸碱滴定分析法酸碱滴定分析法指示终点方法指示终点方法电位法电位法指示剂指示剂水溶液中水溶液中非水溶液非水溶液溴酚蓝溴酚蓝甲基红甲基红溴甲酚蓝溴甲酚蓝酚酞酚酞溴酚蓝溴酚蓝甲基黄甲基黄结晶紫结晶紫净化净化-中性氧化铝；空白试验中性氧化铝；空白试验第21页，共80页。例例 止喘灵注射

14、液中总生物碱的含量测定止喘灵注射液中总生物碱的含量测定酸碱滴酸碱滴定法定法处方处方 麻黄麻黄 洋金花洋金花 苦杏仁苦杏仁 连翘连翘方法方法 精密量取止喘灵注射液精密量取止喘灵注射液10ml，置分液漏斗中，加，置分液漏斗中，加1mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液0.5ml，用三氯甲烷提取，用三氯甲烷提取4次，（次，（10ml、10ml、5ml、5ml）合并三氯甲烷液，置具塞锥形瓶中，精密加硫酸）合并三氯甲烷液，置具塞锥形瓶中，精密加硫酸滴定液（滴定液（0.01mol/L）10ml及新沸过的冷水及新沸过的冷水10ml，充分振摇，加，充分振摇，加茜素黄酸钠茜素黄酸钠指示剂指示剂1-2滴，用氢氧化钠滴

15、定液（滴，用氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）滴定）滴定至淡红色，并将滴定结果用空白实验校正。至淡红色，并将滴定结果用空白实验校正。每每1ml硫酸滴定液相硫酸滴定液相当于当于3.305mg的麻黄碱（的麻黄碱（C10H15NO）。变色范围：变色范围：3.75.2黄黄紫紫第22页，共80页。重量分析法重量分析法重量分析法重量分析法提取重量法提取重量法沉淀法沉淀法适用：混合碱、未知结构、适用：混合碱、未知结构、M差异大差异大优点：简便、不用换算因数无需知优点：简便、不用换算因数无需知M缺点：挥发性、碱性条件下可水解生物缺点：挥发性、碱性条件下可水解生物碱不适用；取样大、操作易乳化、费时碱不适用；取

16、样大、操作易乳化、费时优点：取样少、灵敏度高优点：取样少、灵敏度高缺点：计算复杂、操作繁琐缺点：计算复杂、操作繁琐第23页，共80页。例例 昆明山海棠片中总生物碱成分的含量测定昆明山海棠片中总生物碱成分的含量测定重重量法量法处方处方 昆明山海棠取昆明山海棠片昆明山海棠取昆明山海棠片60片，片，除去糖衣除去糖衣，研细，取约相当于，研细，取约相当于25片的量，精密称定，置片的量，精密称定，置200ml锥形瓶中，锥形瓶中，加适量硅藻土加适量硅藻土（每（每1g中加入中加入硅藻硅藻0.2g），混匀，加），混匀，加乙醇乙醇70ml，加热回流，加热回流40分钟，放冷，滤过，分钟，放冷，滤过，滤渣再加乙醇滤渣

17、再加乙醇50ml，加热回流，加热回流30分钟，放冷，滤过，合并滤液，置分钟，放冷，滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣加水浴上蒸干，残渣加盐酸溶液盐酸溶液（1100）30ml，置水浴上搅拌使溶解，置水浴上搅拌使溶解，放冷，滤过，残渣再用盐酸溶液（，放冷，滤过，残渣再用盐酸溶液（1200）同法提取同法提取3次次（20ml、15ml、15ml），合并滤液溶于分液漏斗中，），合并滤液溶于分液漏斗中，加氨试剂使溶液呈碱性加氨试剂使溶液呈碱性，用，用乙醚乙醚振摇提取振摇提取4次（次（40ml、30ml、25ml、25ml），合并乙醚液，），合并乙醚液，用水振摇洗涤用水振摇洗涤2次，每次次，每次10ml，乙

18、醚液滤过，滤液置已在乙醚液滤过，滤液置已在100干燥至干燥至恒重的蒸发皿恒重的蒸发皿中，在低温水浴上蒸去乙醚，残渣中加入少许无水乙醇，蒸干中，在低温水浴上蒸去乙醚，残渣中加入少许无水乙醇，蒸干，在在100干燥至恒重干燥至恒重，称定重量，计算，即得。，称定重量，计算，即得。第24页，共80页。2分光光度法分光光度法-直接测定法直接测定法 不经过化学反应，利用生物碱物质自身的光吸收直接不经过化学反应，利用生物碱物质自身的光吸收直接进行比色测定的方法。进行比色测定的方法。一般用于药味较少，干扰不大的中药制剂中总生物一般用于药味较少，干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定。碱的含量测定。如：戊己丸如：

19、戊己丸第25页，共80页。生物碱本身具有的颜色生物碱本身具有的颜色 与氧化剂产生颜色与氧化剂产生颜色 因所具有的功能基与试剂反应产生颜色因所具有的功能基与试剂反应产生颜色 根据生物碱的通性与酸性染料、雷氏盐、根据生物碱的通性与酸性染料、雷氏盐、苦味酸盐等结合成有色化合物，并能溶于苦味酸盐等结合成有色化合物，并能溶于有机溶剂中的有机溶剂中的第26页，共80页。1）酸性染料比色法）酸性染料比色法 应用本法的关键在于介质的应用本法的关键在于介质的pH、酸性染料、酸性染料的种类和有机溶剂的选择。的种类和有机溶剂的选择。常用的酸性燃料：甲基橙常用的酸性燃料：甲基橙 溴香草酚蓝（溴香草酚蓝（BTB）溴甲酚

20、绿等溴甲酚绿等第27页，共80页。1）酸性染料比色法）酸性染料比色法-基本原理基本原理B+H+BH+In-BH+In-()水相BH+In-()有机相HInH+第28页，共80页。1）酸性染料比色法）酸性染料比色法 pH的选择：根据染料的性质及生物碱的碱性（的选择：根据染料的性质及生物碱的碱性（pKb）大）大小确定。一元小确定。一元5.26.4二元二元3.05.8 常用的酸性染料：甲基橙、溴香草酚蓝（常用的酸性染料：甲基橙、溴香草酚蓝（BTB）、溴）、溴甲酚绿等甲酚绿等 有机溶剂的选择原则：根据离子对与有机相能否形成有机溶剂的选择原则：根据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱，氯仿等

21、是常用的提取氢键以及形成氢键能力的强弱，氯仿等是常用的提取溶剂。溶剂。在提取过程中，严防水分混入有机溶剂。在提取过程中，严防水分混入有机溶剂。第29页，共80页。例例 风湿骨痛胶囊中乌头总生物碱的含风湿骨痛胶囊中乌头总生物碱的含量测定量测定酸性染料比色法酸性染料比色法方法方法 对照品溶液制备对照品溶液制备 精密称取经精密称取经1050C干燥至恒重干燥至恒重的乌头碱对照品的乌头碱对照品10mg，至，至100ml量瓶中，加三量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含乌头碱中含乌头碱0.1mg）。）。第30页，共80页。标准曲线的制备标准曲线的

22、制备 精密量取对照品溶液精密量取对照品溶液0 ml、1 ml、2 ml、3ml、4 ml、5 ml，分别置于分液漏斗中，依次精密加入三氯，分别置于分液漏斗中，依次精密加入三氯甲烷甲烷20ml，再精密加入，再精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液（称取无水醋酸醋酸盐缓冲液（称取无水醋酸钠钠0.15g，加水使溶解，加冰醋酸，加水使溶解，加冰醋酸5.6ml，用水稀释至，用水稀释至500ml，摇匀，并在摇匀，并在pH计上校正）计上校正）10ml和和0.1%溴甲酚绿溴甲酚绿（取溴甲酚绿（取溴甲酚绿0.2g加加0.05mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液3.2ml使溶解，用水稀释至使溶解，用水稀释至200ml，摇匀

23、），摇匀）2 ml，强力振摇，强力振摇5分钟，静置分钟，静置20分钟，分取分钟，分取三三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，以相应试剂为空白氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，以相应试剂为空白，滤液照分光，滤液照分光光度法，分别在光度法，分别在412nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。第31页，共80页。测定法测定法 取装量差异项下的内容物，研细，取取装量差异项下的内容物，研细，取1g，精密称定，置，精密称定，置具 塞 锥 形 瓶 中，精 密 加 入具 塞 锥 形 瓶 中，精 密 加 入 乙 醚乙 醚-三氯甲烷三氯

24、甲烷-无水乙醇无水乙醇（16 8 1）的混合溶液）的混合溶液25ml和和氨试液氨试液1.5ml，摇匀，称定，摇匀，称定重量，于快速混匀器上振荡三次，每次重量，于快速混匀器上振荡三次，每次2分钟，放置过夜分钟，放置过夜，称定重量，用上述混合溶液补足减失的重量，再于快，称定重量，用上述混合溶液补足减失的重量，再于快速混匀器上振荡速混匀器上振荡2分钟，静置，倾取上清液，精密量取分钟，静置，倾取上清液，精密量取5.0ml，置分液漏斗中，加乙醚，置分液漏斗中，加乙醚5ml，用用0.05mol/L的硫酸溶液的硫酸溶液提取提取4次次，每次，每次10ml，分取硫酸液，滤过，合并滤液，置另一，分取硫酸液，滤过，

25、合并滤液，置另一分液漏斗中，分液漏斗中，第32页，共80页。加加浓氨试剂浓氨试剂4ml，摇匀，用，摇匀，用三氯甲烷三氯甲烷提取提取4次，每次次，每次10ml，分，分取三氯甲烷层，滤过，合并滤液，蒸干，残渣于取三氯甲烷层，滤过，合并滤液，蒸干，残渣于105加加热热1小时，取出，放冷，加三氯甲烷分次溶解，转移至小时，取出，放冷，加三氯甲烷分次溶解，转移至25ml量量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取20ml，置分，置分液漏斗中，照标准曲线制备项下的方法，自液漏斗中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液10.00m

26、l”起，依法测定吸收度，从标起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中乌头碱的量（准曲线上读出供试品溶液中乌头碱的量（g/ml）计算，）计算，即得。即得。第33页，共80页。该法为酸性染料分光光度法，其水相该法为酸性染料分光光度法，其水相pH的选择是离的选择是离子对萃取法取得成功与否的关键，风湿骨痛胶囊测定时的子对萃取法取得成功与否的关键，风湿骨痛胶囊测定时的pH是分别取乌头碱标准液以是分别取乌头碱标准液以pH2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、5.8、6.0、6.2的缓冲液进行试验结果的缓冲液进行试验结果，表明以，表明以pH3.0较为适宜，在该条件下测定供试液吸较为

27、适宜，在该条件下测定供试液吸收度较大，指示液空白试验吸收度较小，且呈色稳收度较大，指示液空白试验吸收度较小，且呈色稳定性较好。定性较好。第34页，共80页。2）苦味酸盐比色法）苦味酸盐比色法 在在弱酸性或中性溶液弱酸性或中性溶液中生物碱可与苦味酸定量生中生物碱可与苦味酸定量生成苦味酸盐沉淀，该沉淀可溶于氯仿等有机溶成苦味酸盐沉淀，该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂，也可以在碱性条件下解离释放出生物碱和剂，也可以在碱性条件下解离释放出生物碱和苦味酸。苦味酸。第35页，共80页。3）雷氏盐比色法）雷氏盐比色法 雷氏盐在雷氏盐在酸性介质酸性介质中可与生物碱类成分中可与生物碱类成分定量定量地生成难溶地生成难溶

28、于水的有色合物。于水的有色合物。将沉淀过滤洗净后溶于丙酮（或甲醇），将沉淀过滤洗净后溶于丙酮（或甲醇），直接直接比色法测比色法测定，换算成生物碱含量。定，换算成生物碱含量。也可精密加入过量的雷氏盐试剂，滤除生成的生物碱也可精密加入过量的雷氏盐试剂，滤除生成的生物碱雷氏盐沉淀，将滤液在雷氏盐沉淀，将滤液在520526nm（溶于甲醇时，其（溶于甲醇时，其max为为427nm）处进行比色，测定残存的过量的雷氏）处进行比色，测定残存的过量的雷氏盐含量，盐含量，间接间接计算生物碱的含量。计算生物碱的含量。第36页，共80页。硫氰化铬铵在丙酮中的摩尔吸收系数硫氰化铬铵在丙酮中的摩尔吸收系数=106=106

29、5 5（单盐（单盐），故可根据其吸收值），故可根据其吸收值A A按下式直接测定而不需绘制标准按下式直接测定而不需绘制标准曲线。曲线。VMAW W W一被测物重量（一被测物重量（mgmg）M M一被测物质的分子量一被测物质的分子量V V一溶解沉淀所用丙酮的一溶解沉淀所用丙酮的mlml数数第37页，共80页。雷氏盐比色法注意事项雷氏盐比色法注意事项u 雷氏盐的水溶液在室温可分解，故用时应新鲜配雷氏盐的水溶液在室温可分解，故用时应新鲜配制，沉淀也需在低温进行制，沉淀也需在低温进行u 供试品如为稀的水溶液（如注射剂等），沉淀前应浓供试品如为稀的水溶液（如注射剂等），沉淀前应浓缩缩,对于中药制剂含有干扰

30、物质时，应事先经过纯对于中药制剂含有干扰物质时，应事先经过纯化处理化处理u 雷氏盐的丙酮或丙酮一水溶液的吸收值，随时雷氏盐的丙酮或丙酮一水溶液的吸收值，随时间而有变化，故应尽快地测定。间而有变化，故应尽快地测定。第38页，共80页。处方处方 益母草益母草 当归当归 人参人参 黄芪黄芪 何首乌何首乌 桃仁桃仁 蒲黄蒲黄 熟地黄熟地黄 香附香附 昆布昆布 白术白术 黑木耳黑木耳对照品溶液制备对照品溶液制备 取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每盐酸溶液制成每1ml含含1mg的溶液，即得。的溶液，即得。供试品溶液的制备供试品溶液的制备

31、取装量差异下的内容物，研细，取取装量差异下的内容物，研细，取12g，精密称定，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50ml，超声处理，超声处理30分钟，滤过，精密量取分钟，滤过，精密量取续滤液续滤液25ml，置，置50ml烧杯中，置水浴上蒸干，精密加入烧杯中，置水浴上蒸干，精密加入0.1mol/L盐盐酸溶液酸溶液10ml使溶解，即得。使溶解，即得。例例 产妇康颗粒中益母草总生物碱的含量测定产妇康颗粒中益母草总生物碱的含量测定雷氏盐比色法雷氏盐比色法第39页，共80页。测定法测定法 取上述对照品溶液和供试品溶液，各加活性炭取上述对照品溶液和供试品溶液，各加活性炭0.

32、5g，置水浴，置水浴上加入上加入1分钟，搅拌，滤过，滤液分别置分钟，搅拌，滤过，滤液分别置25ml量瓶中，用量瓶中，用0.1mol/L盐盐酸溶液酸溶液10ml分次洗涤烧杯和滤器，洗涤液并入同一量瓶中；另取分次洗涤烧杯和滤器，洗涤液并入同一量瓶中；另取0.1mol/L盐酸溶液盐酸溶液20ml置另一置另一25ml量瓶中，作为空白溶液。各精密加新量瓶中，作为空白溶液。各精密加新制的制的2%硫氰酸铬铵溶液硫氰酸铬铵溶液3ml，摇匀，加，摇匀，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，置冰浴中放置摇匀，置冰浴中放置1小时，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以小时，用干燥滤纸滤过，取续滤液，

33、以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在盐酸溶液为空白，在525nm的波长处分别测定吸收度，用空白溶液的吸收度的波长处分别测定吸收度，用空白溶液的吸收度分别减去对照品与供试品的吸收度，计算，即得。分别减去对照品与供试品的吸收度，计算，即得。第40页，共80页。4）异羟肟酸铁比色法）异羟肟酸铁比色法 含有酯键结构的生物碱，在碱性介质中加热，酯键含有酯键结构的生物碱，在碱性介质中加热，酯键水解，产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸，再与水解，产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸，再与Fe3生成紫红色的配合物（异羟肟酸铁），在一定生成紫红色的配合物（异羟肟酸铁），在一定浓度下符合浓度下符合Beer定律，可用比色

34、法进行含量测定。定律，可用比色法进行含量测定。第41页，共80页。（二）生物碱类单体成分的含量测定（二）生物碱类单体成分的含量测定 1薄层色谱法薄层色谱法 2高效液相色谱法高效液相色谱法 3气相色谱法气相色谱法第42页，共80页。1薄层色谱法薄层色谱法 生物碱不具有紫外吸收或挥发性时可用本法测定。生物碱不具有紫外吸收或挥发性时可用本法测定。吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别相似，但要求比鉴别吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别相似，但要求比鉴别严格。严格。注意：使用改良碘化铋钾等作为显色剂时，必须完全挥注意：使用改良碘化铋钾等作为显色剂时，必须完全挥干展开剂后（尤其在碱性环境下展开时）才可喷洒，否干展开

35、剂后（尤其在碱性环境下展开时）才可喷洒，否则背景深，反差小，影响测定。则背景深，反差小，影响测定。第43页，共80页。例例 九分散中士的宁成分的含量测定九分散中士的宁成分的含量测定薄层扫描法薄层扫描法处方处方 马钱子粉马钱子粉 麻黄麻黄 乳香（制）乳香（制）没药（制）没药（制）取本品约取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加三氯甲烷，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加三氯甲烷20ml与浓与浓氨试液氨试液1ml，轻轻摇匀，称重，于室温放置，轻轻摇匀，称重，于室温放置24小时，再称重，补足三氯小时，再称重，补足三氯甲烷减失的重量，充分振摇，滤过。精密量取续滤液甲烷减失的重量，充分振摇，滤过。精

36、密量取续滤液10ml，用硫酸溶液，用硫酸溶液（3100）分次提取，至生物碱提尽，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，）分次提取，至生物碱提尽，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，加浓氨试液使呈碱性，用三氯甲烷分次提取，合并液，蒸干，放冷，残渣加浓氨试液使呈碱性，用三氯甲烷分次提取，合并液，蒸干，放冷，残渣中精密加三氯甲烷中精密加三氯甲烷5ml使溶解，作为供试品溶液。另取士的宁对照品，加三氯使溶解，作为供试品溶液。另取士的宁对照品，加三氯甲烷制成每甲烷制成每1ml含含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶，分别点于同一硅胶GF25

37、4薄层板上，以甲苯一丙酮一乙醇一浓氨薄层板上，以甲苯一丙酮一乙醇一浓氨试液（试液（16 12 1 4）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法进行扫描，波长：薄层色谱法进行扫描，波长：s=254nm，R=325nm，测量供试品吸收，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。第44页，共80页。以反相高效液相色谱法应用较多。以反相高效液相色谱法应用较多。在反相高效液相色谱中，由于硅胶表面残留硅羟基的在反相高效液相色谱中，由于硅胶表面残留硅羟基的影响，使生物碱分析易产生保留时间延长、峰形变宽

38、、影响，使生物碱分析易产生保留时间延长、峰形变宽、拖尾；可采取改进流动相、固定相等措施以克服游离拖尾；可采取改进流动相、固定相等措施以克服游离硅羟基的影响，满足定量分析的要求。硅羟基的影响，满足定量分析的要求。中药制剂中生物碱成分进行高效液相色谱法测定时，中药制剂中生物碱成分进行高效液相色谱法测定时，使用较多的是紫外检测器。使用较多的是紫外检测器。第45页，共80页。例例 小孩清热止咳口服液中盐酸麻黄碱含量小孩清热止咳口服液中盐酸麻黄碱含量测定测定高效液相色谱法高效液相色谱法处方处方 麻黄、苦杏仁、石膏、甘草等麻黄、苦杏仁、石膏、甘草等色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 用十八烷

39、基硅烷键合硅胶为填充用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈剂；乙腈-0.1%磷酸溶液磷酸溶液(含含0.1%三乙胺三乙胺)（397）为流动相；）为流动相；检测波长为检测波长为205nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于4000。对照品溶液的制备对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱对照品适量，精密称定，加取盐酸麻黄碱对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每盐酸溶液制成每1ml含含45g 的溶液，即得。的溶液，即得。第46页，共80页。供试品溶液的制备供试品溶液的制备 精密量取本品精密量取本品5ml，加水，加水10ml及浓氨水及浓氨水0.5ml用乙醚提取用

40、乙醚提取5次（次（30ml，30ml，20ml，20ml，20ml），合并乙醚液，加盐酸乙醇溶液（，合并乙醚液，加盐酸乙醇溶液（120）2 ml，混匀，低，混匀，低温回收溶剂至干，残渣加乙醇温回收溶剂至干，残渣加乙醇5 ml使溶解，转移至使溶解，转移至25ml量瓶量瓶中，加中，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。测定法测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l，注入液相，注入液相色谱仪，测定，即得。色谱仪，测定，即得。第47页，共80页。只适用于有挥发性、遇热不分解的生物碱类。只适用于有挥发性、遇热不分解的生物碱

41、类。生物碱盐在急速加热过程中产生的酸对色谱柱和检测生物碱盐在急速加热过程中产生的酸对色谱柱和检测器不利，应该注意。器不利，应该注意。制备供试品溶液时一般采用冷提取，净化过程也要避免加制备供试品溶液时一般采用冷提取，净化过程也要避免加热，以防止成分流失，最后需用氯仿等低极性有机溶剂为热，以防止成分流失，最后需用氯仿等低极性有机溶剂为溶剂制备成供试液。溶剂制备成供试液。第48页，共80页。第二节第二节 黄酮类成分分析黄酮类成分分析 概述概述 一般性质一般性质 鉴别鉴别 含量测定含量测定第49页，共80页。黄酮类化合物是指基本母核为黄酮类化合物是指基本母核为2-苯基色原苯基色原酮类酮类化合物。化合物

42、。现泛指两苯环通过中央三碳键相互联结而现泛指两苯环通过中央三碳键相互联结而成的一系列化合物。成的一系列化合物。在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。以游离形式存在。第50页，共80页。OOHOHOHOOHHOQuercetin槲皮素槲皮素OOOHIsorhamnetin异槲皮素异槲皮素OOHOHOHOHHOHHEpictechin表儿茶素表儿茶素OHOHOOHOOHOHOHOHOOHHyperoside金丝桃苷金丝桃苷第51页，共80页。溶解度溶解度 酸碱性酸碱性 紫外光谱特征紫外光谱特征第52页，共80页。黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态

43、（苷或苷元，黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态（苷或苷元，单糖苷、双糖或三糖苷）不同而有很大差异。单糖苷、双糖或三糖苷）不同而有很大差异。游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶与苯、氯仿等。难溶或不溶与苯、氯仿等。第53页，共80页。酸性：酸性：黄酮类化合物因分子中多有羟基，故显酸性，可溶于碱性黄酮类化合物因分子中多有羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基

44、甲酰胺中。水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。碱性：碱性：氧原子的性质：黄酮类化合物分子中氧原子的性质：黄酮类化合物分子中-吡喃酮环上的吡喃酮环上的1位氧原子，因有未共用的电子对，故表现出微弱的碱性，可位氧原子，因有未共用的电子对，故表现出微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，常表现出特殊的颜色，与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，常表现出特殊的颜色，可用于鉴别。可用于鉴别。生成的盐极不稳定，加水后即可分解。生成的盐极不稳定，加水后即可分解。第54页，共80页。显色反应显色反应 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及羟基及-吡喃酮环有关。吡

45、喃酮环有关。1还原反应还原反应 2与金属盐类试剂的络合反应与金属盐类试剂的络合反应第55页，共80页。1还原反应还原反应 常用：与盐酸常用：与盐酸-镁粉（或锌粉）的反应。镁粉（或锌粉）的反应。反应时多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化反应时多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物显橙红合物显橙红-紫红色，少数显紫紫红色，少数显紫-蓝色，且蓝色，且B环上有环上有-OH或或-OCH3取代时，颜色即随之加深。取代时，颜色即随之加深。查耳酮、橙酮、儿茶素类则不发生色变。查耳酮、橙酮、儿茶素类则不发生色变。花青素及部分橙酮，查耳酮等在单纯浓盐酸下也会发生花青素及部分橙酮，查耳酮等在单纯浓盐酸

46、下也会发生色变，须预先作一对照，以便排除。色变，须预先作一对照，以便排除。第56页，共80页。黄酮类化合物分子中有游离的黄酮类化合物分子中有游离的3-OH、5-OH或邻二酚羟基时可或邻二酚羟基时可与与Al3、Zr4+、Pb2、Sr2+等形成配合物，这些配合物有的产等形成配合物，这些配合物有的产生荧光或颜色加深（如生荧光或颜色加深（如Al3、Zr4+），有的产生沉淀（如），有的产生沉淀（如Pb2、Sr2+）。）。Al3：1%AlCl3或或Al(NO3)3;黄色黄色(max=415nm)，有荧光，有荧光Pb2：1%PbAc2或碱式或碱式PbAc2；黄黄红红，有荧光，有荧光Zr4+：2%ZrOCl2

47、的甲醇溶液；的甲醇溶液；枸椽酸，枸椽酸，5-OH黄酮的黄色黄酮的黄色aq显著显著褪色；褪色；3-OH黄酮的黄酮的aq呈鲜黄色呈鲜黄色第57页，共80页。因有因有2-苯基色原酮的基本结构，具有特定的紫外吸收峰，苯基色原酮的基本结构，具有特定的紫外吸收峰，两个较强的吸收带：两个较强的吸收带：带在带在300400nm范围内，由范围内，由B环桂皮酰基引起。环桂皮酰基引起。带在带在240285nm范围内，由范围内，由A环上的苯甲酰基引起。环上的苯甲酰基引起。黄酮类化合物当加入一些移位剂如甲醇钠、醋酸钠、黄酮类化合物当加入一些移位剂如甲醇钠、醋酸钠、氯化铝等，可使最大吸收波长发生位移。选择性提高，氯化铝等

48、，可使最大吸收波长发生位移。选择性提高，可消除杂质的干扰，有利于含量测定。可消除杂质的干扰，有利于含量测定。第58页，共80页。三、鉴别三、鉴别（一）显色反应（一）显色反应（二）薄层色谱鉴别（二）薄层色谱鉴别第59页，共80页。黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及羟基及-吡喃酮环有关。吡喃酮环有关。1还原反应还原反应 2与金属盐类试剂的络合反应与金属盐类试剂的络合反应第60页，共80页。1还原反应还原反应-方法方法 为将甲醇或乙醇提取液为将甲醇或乙醇提取液510ml，加入几滴浓盐酸，加入几滴浓盐酸，然后加入少许镁（或锌）粉（必要时微热），如果有然后加入

49、少许镁（或锌）粉（必要时微热），如果有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇存在，数分钟黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇存在，数分钟后即可出现橙色红色。后即可出现橙色红色。此反应要先加盐酸再加镁粉，因为像花色素等成分在单纯加此反应要先加盐酸再加镁粉，因为像花色素等成分在单纯加盐酸后就能产生颜色变化；为避免在该反应中供试品液本身盐酸后就能产生颜色变化；为避免在该反应中供试品液本身颜色的干扰，可注意观察上升的泡沫颜色的干扰，可注意观察上升的泡沫(阳性阳性)第61页，共80页。例例 牛黄解毒片（黄芩）的鉴别：牛黄解毒片（黄芩）的鉴别：取本品取本品6片，研细，加乙醇片，研细，加乙醇10ml，温热，温热1

50、0分钟，滤分钟，滤过，取滤液过，取滤液5ml，加盐酸，加盐酸0.5ml与少量镁粉，加热，溶与少量镁粉，加热，溶液显红色。液显红色。第62页，共80页。2与金属盐类试剂的络合反应与金属盐类试剂的络合反应例例 银黄注射液的鉴别：银黄注射液的鉴别：取本品取本品1ml于试管中，加于试管中，加5%亚硝酸钠溶液、亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液各硝酸铝溶液各0.3ml，溶液呈黄色；另取注射，溶液呈黄色；另取注射液液0.1ml，加水，加水10ml，摇匀，取稀释液，摇匀，取稀释液2ml，加，加5%二氯氧锆溶液二氯氧锆溶液1-2滴，溶液呈黄色，再加盐酸滴，溶液呈黄色，再加盐酸1-2滴，颜色不褪。滴，颜色不褪。第6