口腔细菌的培养及应用.课件.ppt
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- 口腔 细菌 培养 应用 课件
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1、口腔细胞培养及其应用武汉大学口腔医学院 郭继华第一节 细胞培养一、细胞培养的基本原理n细胞培养:模拟体内的生理环境,在适当的条件下,使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖,并维持其结构功能。培养细胞的形态特点 贴壁型细胞:必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长,属于贴壁依赖性细胞按照培养细胞的主要形态,可分为几大类型v 成纤维细胞型胞体呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质突起,生长时呈放射状、火焰状、漩涡状。除真正的成纤维细胞外,凡由中胚层间充质起源的组织,如心肌、平滑肌细胞等等常呈本型状态。另外,凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。v 上上皮型细胞细胞呈
2、扁平不规则多角形,中央有圆形核,细胞彼此紧密相连成单层膜,生长时呈膜状移动,起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。v 游走细胞型在支持物上呈散在生长,一般不连成片,胞质常突起,呈活跃游走或变形运动,方向不规则。此型细胞不稳定,有时难以和其他细胞相区别。v 多型细胞型有一些细胞,如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态,可统归于此类。悬浮型细胞:于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面,见于某些癌细胞和血液淋巴细胞o培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长o 来自血,脾或骨髓o 在悬浮中生长良好细胞圆形,单个或小细胞团
3、o 生存空间大,提供数量大,传代方便(不需消化),易于收获,可获得稳定状态o 观察不方便培养细胞的生长和增殖过程培养细胞的生长和增殖过程 v 培养细胞生命期培养细胞生命期所谓培养细胞生命期,是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。o 原代培养原代培养期:期:也称初代培养,即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段,一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动,可见细胞分裂,但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的,也即各细胞的遗传性状互不相同,细胞相互依存性强。细胞独立生存性差。初代培养细胞多呈二倍体核型;由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大,是检测药物很好的实
4、验对象。o 传代期:传代期:初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下,细胞增殖旺盛,并能维持二倍体核型,呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质,细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。反复传代就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止,细胞进入第三期。o 衰退期:衰退期:此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;细胞形态轮廓增强,最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段,少数情况下,在以上三期任何一点(多发生在传代末或衰退期),由于某种因素的影响,细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是
5、细胞可能获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性,即细胞获持久性增殖能力,这样的细胞群体称无限细胞系,也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末,或第三期初阶段。细胞获不死性后,核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发,转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。v 培养细胞一代生存期培养细胞一代生存期所谓细胞“一代”一词,系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间,这已成为培养工作中的一种习惯说法,它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第n代细胞,即指该细胞系已传代n次。在细胞一代中,细胞能倍增36次。细胞传一代后,一般要经过以下三个阶段:n潜伏期(游离期,
6、贴壁期)n对数生长期n停止期(平台期)潜伏期:潜伏期:细胞接种培养后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩,胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上,称贴壁,悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同,这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢,可长达1024小时或更多;连续细胞系和恶性细胞系快,1030分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附;底物表面不洁不利贴附,底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中,有一些特殊物质如纤维连接素,细胞表面蛋白等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分,它们有的
7、存在于细胞膜的表面,有的则来自培养基中的血清。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。初代培养细胞潜伏期长,约2496小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅624小时;细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时,标志细胞已进入指数增生期。指数增生期:指数增生期:这是细胞增值最旺盛的阶段,细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%,初代细胞分裂指数低,连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。特点:特点:是细胞是细胞增生最活跃增生最活跃、活
8、力最旺盛活力最旺盛的阶段的阶段培养物中培养物中细胞数量呈指数增长细胞数量呈指数增长,细胞群体均一细胞群体均一是理想的实验用细胞是理想的实验用细胞在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续35天后,随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后,如培养的是正常细胞,由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动,这种现象称接触抑制。细胞接触汇合成片后,虽发生接触抑制,只要营养充分,细胞仍然能够进行增殖分裂,因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养的枯竭和代谢物的影响,则发生密度抑制,导致细胞分裂停止。停滞期:停滞期:细胞数量
9、达饱和密度后,细胞遂停止增殖,进入停滞期。此时细胞数量不再增加,故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,继而培养液中营养渐趋耗尽,代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代,否则细胞会中毒,发生形态改变,重则从底物脱落死亡,故传代应越早越好。培养细胞的体外生长环境v 无污染环境超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒,使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面,使工作台内构成无菌环境。滤 器n压力蒸汽消毒器:压力蒸汽消毒器:湿热消毒,用途广n电热干燥箱:电热干燥箱:干热消毒(160 ,2小时)。主要用干玻璃n器皿消毒 n滤器:滤器:过滤除菌:大
10、多数培养用液,如人工合成培养基、血清、n酶液等均采用滤过法除菌 n超净工作台:超净工作台:为细胞操作提供无菌环境n紫外灯紫外灯:紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料n培养皿和培养板等表面消毒 n v 基 质玻璃基质塑料饲养细胞生物性基质处理培养表面金属v 气体环境和氢离子浓度Hepers 缓冲液CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-CO2:5%v 液相环境水:新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液:无Ca2+、Mg2+的缓冲液 天然培养基天然培养基:天然培养基有血清、血浆、和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。优点:营养成分丰富,培养效果好缺点:来源受限。成分复杂,影响对某些实验产物的提
11、取和实验结 果的分析。易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基,如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点:标准化生产,组分和含量相对固定。成本低 缺点:缺少某些成分,不能完全满足体外细胞生长需要。n 人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细胞生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如血清)。血清中含有:多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等)多种金属离子;激素;促贴附物质,如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白
12、不明成分n无血清培养基的主要研制策略:在基础培养基中补充各种必需因子,如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子 等。n无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。n无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性,减少了细胞污染,简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。v 温度v 渗透压二、细胞培养的基本方法无菌操作技术无菌操作技术 体外培养细胞缺乏抗感染能力,所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室,若实验者粗心大意,技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌,每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。v 培养前准备 在开
13、始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求,准备各种所需器材和物品放置操作场所(培养室、超净台)内消毒。这可以避免开始实验后,因物品不全往返拿取而增加污染机会。v 培养室的消毒 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用),紫外线照射消毒30-50min,超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。v 洗手和着装 原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75酒精消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液
14、洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。v 培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时,首先要点燃酒精灯。以后一切操作,如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等,都需在火焰近处并经过烧灼进行。进行培养时,动作要准确敏捷,但又不必太快,以防空气流动,增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰烧灼消毒或取备品更换。基本培养操作技术基本培养操作技术 v 培养细胞的取材与分离取材部位准确严格无菌操作尽快培养减小损伤制备标本分散组织 机械分离法 消化分离法v 培养细胞的纯化人工纯化(酶消化法,机械刮除法,反复 贴壁法,克隆法等)自然纯化v 细胞的冻存与复苏所谓冷冻保存,
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