基因芯片第三章基因芯片的制作方法课件.ppt

1、第三章第三章 基因芯片的制作方法基因芯片的制作方法3.1 概述概述 1.基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础发展起来的。反向杂交技术2.基因芯片的制作方法：原位合成法：Affymetrix公司 直接点样法（合成后点样）：Stanford大学，1995年项目项目原位合成法原位合成法直接点样法直接点样法探针预备探针预备不需要不需要需要需要探针类型探针类型寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸，寡核苷酸，cDNA，基因组，基因组DNA，蛋白等，蛋白等探针长度探针长度约约25nt不限制不限制联合合成联合合成需要需要不需要不需要芯片表面点样芯片表面点样不需要不需要需要需要密度密度高高低低制作成本制作成本高高

2、低低应用应用基因表达，突变检测基因表达，突变检测 基因表达，突变检测，基因表达，突变检测，CGH1.常见的载体类型 膜 玻片 三维基质包被玻片3.2 芯片载体的制作芯片载体的制作（1）膜 优点：与核酸亲和力强。缺点：单位面积上点样密度低；背景较高；灵敏度低。（2）玻片 优点：耐受高温和高离子强度；具有不浸润性，提高点样密度；背景低。缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻。（3）三维基质包被玻片 具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持物，可以保持蛋白质的空间构象，不影响它的活性。表1 基因芯片不同载体性能对比载体类别载体类别阵列密度阵列密度所需探针量所需探针量检测方法检测方法标记标

3、记膜膜低低高高放射性放射性单色单色玻片玻片高高低低多种多种彩色彩色2.探针分子与基片表面的作用方式 化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学反应，生成新的共价键。物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。3.玻片的修饰类型l氨基修饰玻片l同型双功能偶联剂修饰的玻片l硫醇基修饰的玻片l环氧硅烷化修饰的玻片等图图3-3 APS修饰玻璃表面反应示意修饰玻璃表面反应示意（1）氨基修饰的玻片羟基羟基氨基氨基对苯乙异硫氰酸（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片异硫氰基异硫氰基醛基醛基戊二醛图图3-6 寡核苷酸探针固定在寡核苷酸探针固定在PDC基片上的原理基片上的原理连接分子连接分子手臂分子手臂分子特

4、异性探针特异性探针图图3-7 SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片连接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）连接硫醇基修饰的玻片硫醇基硫醇基图图3-8 环氧硅烷化玻片修饰示意环氧硅烷化玻片修饰示意（4）环氧硅烷化修饰的玻片环氧硅烷基环氧硅烷基图图3-9 在硅烷化玻片上生成树形连接分子系统的示意在硅烷化玻片上生成树形连接分子系统的示意（5）聚酰胺树形连接分子系统修饰的玻片1.cDNA探针2.寡核苷酸探针3.基因组DNA探针（很少用）3.3 探针的制备探针的制备cDNA探针：主要来自cDNA文库，从细胞或组织中提取RNA后逆转。寡核苷酸探针：根据数据库中的基因序列人工合成的。通常在5末端进行氨基修饰，并加入一

5、段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用poly dT(10)。手臂分子手臂分子特异性探针特异性探针表2 寡核苷酸与cDNA 对比类别类别需要需要序列序列种类种类交叉交叉点样点样密度密度DNA长度长度摩尔摩尔比率比率杂交杂交速率速率交叉交叉杂交杂交质量质量控制控制适应适应性性寡核寡核苷酸苷酸是是无无高高固定固定均衡均衡快快低低容易容易高高cDNA否否有有低低多样多样多样多样慢慢高高困难困难低低3.4 点样仪及点样过程点样仪及点样过程l接触式点样l非接触式点样1.接触式点样 点样针。基本过程：点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象，使液体转移到针尖或针的狭缝中。针尖再接触基片，样品在

6、基片上留下斑点，完成一次点样。点样针的种类：实心针（solid pin）裂隙针（split pin）毛细管针（capillary tube）针与环（pin and ring）图图3-13 Amersham公司的公司的Molecular Dynamics Generation Array 点样仪及毛细管点样针点样仪及毛细管点样针2.非接触式点样（自学）（1）微螺线阀 （2）压电元件接触式接触式非接触式非接触式 压电元件压电元件微螺线阀微螺线阀1 1 图图3-2 当前当前59家芯片设备生产商使用的点样针分布情况家芯片设备生产商使用的点样针分布情况（图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）（图中的数字

7、代表使用各点样针的厂家数目）3.5 原位合成法操作平台Affymetrix芯片的特点：光导原位合成的寡核苷酸芯片 高密度的点阵技术 独特的PM-MM探针设计 1.光导原位合成原理2.高密度的点阵技术 1个平方厘米的面积至少可排列几十万到一百多万个探针合成区（“点”）3.Affymetrix独特的PM-MM探针设计图图3-24 PM-MM探针设计方案探针设计方案高灵敏度图图3-26 仅用仅用PM探针与联合应用探针与联合应用PM-MM探针检测靶序列的灵敏度比较探针检测靶序列的灵敏度比较特异性和灵敏度的提高MM探针的作用：内参 提高特异性背景信号 提高灵敏度芯片结果准确可靠图图3-25 PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较的多个探针的结果与单个探针的结果比较图图3-27 Affymetrix芯片的重复性实验（信号值的散点图）芯片的重复性实验（信号值的散点图）4.光导原位合成法的缺点1.需要避光掩膜，造价高；2.光脱保护方式，造成光衍射，制约探针密度的提高3.对研究者而言，每次实验只是使用芯片探针的一部分，探针浪费严重