基因工程菌的发酵35张幻灯片.ppt

1、l基因工程菌的安全性l基因工程菌的稳定性问题l影响基因工程菌发酵的因素l基因工程菌的高密度培养l基因工程菌发酵的动力学模型l基因工程菌的安全性受到关注的原因基因工程菌都含有外源DNA片段，其遗传结构与自然界中的DNA相比有较大的差别一般含有抗生素抗性基因有的含有病毒的遗传信息l基因工程菌泄露的防护措施物理防护l实验室规模上有P1-P4四个等级l工业规模上则有LS1、LS2两个等级lLS-1的设备标准 培养装置密闭 排气经过无菌过滤生物防护lEK1-EK3三个等级l 外源基因表达系统可以分为两种类型质粒-宿主表达系统l外源基因位于工程菌的质粒上l存在质粒的不稳定性整合型表达系统l外源基因位于宿主

2、菌的染色体上l稳定性的问题相对不太严重l引起质粒-宿主表达系统不稳定性的因素不含质粒的细菌对工程菌的生长优势质粒分配的不稳定性l质粒在子代微生物中的不均一分配质粒结构的不稳定性l质粒DNA易发生突变，同时也容易受到宿主菌核酸酶的攻击l考虑一个质粒-宿主表达系统kNPkPaS)2(NNbS2)1(211knkkF12l培养条件对工程菌稳定性的影响培养基的影响l复合培养基(完全培养基)对质粒的稳定性有利l基本培养基比生长速率l比生长速率高时有利于质粒稳定l培养条件对基因工程菌稳定性的影响温度l高温时质粒的稳定性较差pHlpH接近于基因工程菌的最适生长pH时质粒的稳定性较高溶氧l在基因工程菌的发酵过

3、程中保持较高的溶氧有利于质粒的稳定l培养条件对工程菌稳定性的影响细胞的固定化l固定化细胞可以提高质粒的稳定性外源基因的表达l外源基因的表达会引起质粒的不稳定性问题l采用可诱导的表达方式l基因工程菌发酵的特殊性生长速度比野生菌株慢存在稳定性的问题外源基因的表达一般需要诱导l化学诱导 IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，乳糖等l热诱导l外源基因表达的一般过程复制l质粒的稳定性转录l诱导l分解代谢物阻遏翻译lmRNA的半衰期(寿命)l氨基酸是否供给充分表达后的修饰和分泌l培养基对基因工程菌发酵的影响培养基的浓度和配比不但影响菌体的生长，而且影响外源蛋白的表达一般而言营养丰富的复合培养基比合成培养基的效果

4、好，缓慢利用的碳源比葡萄糖的效果好不同的表达系统对营养物质有不同的要求相同的表达系统在表达不同的外源蛋白时也对培养基有不同的要求l发酵过程中比生长速率的影响比生长速率的影响尚无定论因不同的表达系统而异l有的表达系统需要高的比生长速率l有的则需要比较低的比生长速率l有的工程菌的表达效率在比生长速率为零时(稳定期)最高l温度的影响温度影响质粒的稳定性影响细胞内酶的活性和重组蛋白的合成速度影响重组蛋白的稳定性l较低 的温度下重组蛋白稳定有些表达系统采用热诱导l诱导温度的确定l溶氧(DO)的影响溶氧对基因工程菌发酵的影响取决于工程菌的特性l宿主菌为需要菌时一般要有较高的溶氧l宿主菌为厌氧菌时则需要厌氧

5、培养l诱导诱导时机l由于外源蛋白的表达对工程菌的生长有抑制作用，故一般在对数生长后期进行诱导诱导剂量l过量诱导往往对细胞生长和代谢活性以及基因的表达具有抑制作用l使用热诱导时不能用过高的温度l代谢副产物的影响常见的基因工程菌产生的抑制性代谢副产物l大肠杆菌产生乙酸l枯草杆菌产生乙酸和丙酸l酵母产酒精解决代谢副产物抑制的方法l控制快速利用碳源(葡萄糖)的浓度l使用缓慢利用碳源l在线分离抑制物质l基因工程菌的稳定性对发酵的影响发酵液中丢失质粒的工程菌数量多解决这一问题的方法l构建更为稳定的工程菌l使用整合型的表达系统l使用可诱导的表达系统并控制诱导的时机，将基因工程菌的生长和外源蛋白的表达分开进行

6、l在发酵过程中使用抗生素抑制野生菌的生长l若每个基因工程菌产生重组蛋白的能力相同，则重组蛋白的生产能力与菌体量成正比XqdtdPPl实现基因工程菌高密度发酵的方法流加培养技术先采用合适的流加培养技术将基因工程菌培养到一定的浓度(如50gDCW/L)然后通过诱导启动重组基因的表达l建立基因工程菌发酵动力学模型应从基因工程菌发酵与一般的微生物发酵的差别着手质粒的不稳定性l野生菌的生长优势l结构的不稳定性l分配的不稳定性重组蛋白质的表达诱导lLee的模型发表在Bioengineering and Biotechnology(生物工程与技术)上充分考虑了质粒的不稳定性，将培养液中的微生物分为三种l正常的基因工程菌l质粒结构发生变化的工程菌l野生菌考虑了细胞内mRNA的合成与外源蛋白表达的关系11111)1(XXdtdX11222)1(XXdtdX2211333XXXdtdXdtdPYdtdXYdtdXYdtdXYdtdSP1111332211mmkGkdtmddoP1PPkmkdtPdeoq111XdtdXdtdP