大肠杆菌基因工程菌的构建策略课件.ppt

1、大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白

2、质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体表达形式的优点：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性

3、，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作C

4、 共价修饰的蛋白质蛋白质变性复性的动力学原理：C1C2CnCUI 1I nNX1X2XnXAgAgAgAgI 有效变复性过程中的中间状态X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态N 天然状态的蛋白质U 变性状态的蛋白质A 集聚状态的蛋白质在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵

5、体溶解变性的试剂和条件包括：清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强 极端pH 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：通过次级键的形成使蛋白质复性将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：复性操作 包涵体复性操作的方法包

6、括：分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：二硫键形成在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽

7、（GSH和GSSG），二硫键止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有：随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好HSHS S S+2e+2H+AHSHS S-S-R HS+BR-S-S-R S S2R-SH分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条

8、件分泌型异源蛋白的表达以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳 稳定性大约是在细胞质中的10倍目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有 甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质 N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠 杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去分泌型异源蛋白的表达以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌

9、中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍分泌型异源蛋白的表达蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感 分泌型异源蛋白的表达分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释

10、放蛋白，它激活定位于内上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。融合型异源蛋白的表达 除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引

11、入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白融合型异源蛋白的表达以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件 胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性 目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段 行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获融合型异源蛋白的表达融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表

12、达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着为目的蛋白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，融合蛋白的裂解工艺两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 融合型异源蛋白的表达融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST）维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（TrxA）维持良好空间构象 pTrxFus麦芽糖结合蛋白（MBP）促进分

13、泌金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫亲和层析 pRIT2T外膜蛋白（OmpF）促进分泌b-半乳糖苷酶（LacZ）免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi）维持良好空间构象融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收 融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：化学断裂法 酶促裂解法 融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者

14、不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高（可达到85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法化学断裂法：融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收酶促裂解法：单残基位点蛋白内切酶切割位点梭菌蛋白酶 Arg-C葡萄球菌蛋白酶 Glu-C假单孢菌蛋白酶 Lys-C猪胰蛋白酶 Arg-C Lys-C蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，同时每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决

15、定簇，因此可供选择的专一性断裂位点范围较广。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的Arg CNNC受体蛋白目的蛋白融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收酶促裂解法：多残基位点 为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一

16、段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收酶促裂解法：多残基位点启动子 受体基因 接头 目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表达亲和层析酶解回收融合型异源蛋白的表达目

17、的蛋白的回收酶促裂解法：多残基位点Pinpoint Xatac生物素结合肽编码序列Xa因子识别位点编码序列SP6T7AproriMCSATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGCATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGCXa-1Ile Glu Gly ArgIle Glu Gly Arg GluGluATC GAA GGT CGC GAA ATC GA

18、A GGT CGC GAA A AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG CGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG CXa-2ATC GAA GGT CGC GAA ATC GAA GGT CGC GAA AAAAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GCG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA T

19、CT CCC GGG GCG GCC GCXa-3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotIXa因子切割位点寡聚型异源蛋白的表达 从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果。另一种通过增加外源基因剂量而

20、提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略寡聚型异源蛋白的表达以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白高效表达在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以稳定表达小分子短肽在一定程度上改善表达量目的产物回收困难短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性寡聚型异源蛋白的表达寡聚型目的蛋白表达系统的构建PSDgeneg

21、enegenegeneT1 T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本战略：寡聚型异源蛋白的表达寡聚型目的蛋白表达系统的构建构建举例：P SDT1 T2EcoRIBamHIAATTCAGATCT GTCTAGAGCCTAGEcoRI Bgl IIBamHIEcoRIBamHIBgl II GATCT AGCCTAGEcoRIBamHIBgl IIEcoRIBamHIBgl IIEcoRI+BamHIBgl II+BamHIBamHI整合型异源蛋白的表达以整合形式表达目的蛋白的优缺点目的基因稳定表达整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大多数情况下相当稳定，工

22、程菌在没有选择压力存在下可以连续目的基因表达率低单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达元件而加以补偿培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程案例特别有意义整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理 在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进化。细胞内的遗传重组可分为两大类：转位因子依赖型同源序列依赖型整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理 转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如：转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族噬

23、菌体 G片段（G-Fragment）原核细菌 插入顺序（IS）真核细菌 转座子（Tn、Ty）高等植物 可移动因子（Ac、Ds）高等动物 跳跃基因（mobil gene）整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理转位因子依赖型的体内重组：转位因子的结构IS（1 kb）Ty（5 kb）Tn（2-20 kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗药性基因转位酶基因识别位点 阻遏基因IRIRIRIRISIS整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理转位因子依赖型的体内重组：整合形式整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理 在很多原核细菌细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生所谓的同源重

24、组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离同源区的长度、同源程度密切相关。一般地说，距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点同源序列依赖型的体内重组：基本形式整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理同源序列依赖型的体内重组：同源整合ori目的基因同源区域标记基因整合位点染色体DNA整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理同源序列依赖型的体内重组：同源交换ori目的基因同源区域标记基因交换区域染色体DNAori标记基因+蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 无论是在真核生物还是在原核细胞中，重组

25、目的蛋白表达后都会面临被降解的命运，其稳定性甚至还不如半衰期较短的受体细胞内源性蛋白质。在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明，重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的人工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 实验结果表明，大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌中的蛋白酶La和Ti降解的，两者分别由lon和clp基因编码，其蛋白水解活性依赖于ATP。lon基因由热休克等环境压力激活，细胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种环境压力诱导lon基因的表达。lon-的大肠杆菌突变株可使原

26、来半衰期较短的细菌调控蛋白（如SulA、RscA、lN）稳定性大增，因此被广泛用作外源基因高效表达的受体菌。蛋白酶缺陷型受体细胞的改造lon基因缺陷的大肠杆菌受体（lon-）：蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族对异常或异源蛋白的降解也有重要作用，其机理是胁迫异常或异源蛋白形成一种对蛋白酶识别和降解较有利的空间构象，从而提高异常或异源蛋白对蛋白酶的敏感性。热休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及环境压力特异性s因子编码基因htpR的突变株均呈现出对异源蛋白降解作用的严重缺陷，特别是lon-htpR-的双缺陷株，非常适合高效表达各种不稳定的重组异源蛋白。

27、蛋白酶缺陷型受体细胞的改造htpR基因缺陷的大肠杆菌受体（htpR-）：蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 大量的实验结果表明，在所有的极性氨基酸中，天门冬氨酸（Asp）的存在对提高蛋白质稳定性的效应最显著，而且Asp残基离C末端越近，蛋白质的稳定性就越大。更为重要的是，在多种结构和功能相互独立的蛋白质C末端引入Asp残基，都能显著地延长这些蛋白质的半衰期，因此具有普遍意义。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链C末端氨基酸序列对稳定性的影响：蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 大量的实验结果同时表明，如果多肽链的N末端序列中含有较高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，则蛋白质的稳定性显著改善。相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞内蛋白酶的超敏感区。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链N末端氨基酸序列对稳定性的影响：