大肠杆菌基因工程菌的构建策略课件.ppt
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- 大肠杆菌 基因工程 构建 策略 课件
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1、大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质 在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB)。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中,由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能,从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白
2、质,后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外,包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体表达形式的优点:包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分,菌体经超声波裂解后,直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后,大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的缺点:以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性
3、,必须通过有效的变性复性操作,才能回收得到具有正确空间构象(因而具有生物活性)的目标蛋白,因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而,这也是一个技术难题,尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时,体外复性蛋白质的成功率相当低,一般不超过30%包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计(如分泌型表达或融合型表达),外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时,表达产物一般倾向于形成包涵体。因此,以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上,这种高表达率也是包涵体法的长处所在包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作C
4、 共价修饰的蛋白质蛋白质变性复性的动力学原理:C1C2CnCUI 1I nNX1X2XnXAgAgAgAgI 有效变复性过程中的中间状态X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态N 天然状态的蛋白质U 变性状态的蛋白质A 集聚状态的蛋白质在细菌细胞内,集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程,因此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态,因此需要在体外进行人工变性(解除共价修饰和驱散集聚体)复性操作包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性:包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键在人工条件下,使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵
5、体溶解变性的试剂和条件包括:清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸,廉价,但影响复性和纯化 促溶剂 盐酸胍、尿素,前者昂贵,尿素便宜,但常被自发 形成的氰酸盐污染,后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用,溶解力增强 极端pH 廉价,但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠(refolding):包涵体的复性与重折叠的主要任务是:通过次级键的形成使蛋白质复性将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠(refolding):复性操作 包涵体复性操作的方法包
6、括:分段稀释法,逐步降低变性剂的浓度,防止二次集聚的发生一步稀释法,蛋白复性与浓度无关,但集聚与浓度关系很大试剂添加法,精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法,氨基柠檬酸酐酰化,蛋白带负电,抑制集聚产物隔离法,将变性的蛋白分子固定化,避免其相互碰撞分子伴侣法,GroEL、GroES、DnaK,固定化,共表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠(refolding):二硫键形成在包涵体变性体系中,始终存在着还原剂,使多肽链中的巯基保持还原状态,防化学氧化法(A)需要电子受体,最廉价的电子受体为空气,二硫键形成是二硫键交换(B)需要还原型和氧化型谷胱甘肽
7、(GSH和GSSG),二硫键止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后,这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键,此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有:随机的,仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 形成相对特异,因此适用性较广,重折叠效果好HSHS S S+2e+2H+AHSHS S-S-R HS+BR-S-S-R S S2R-SH分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式:即以可溶性或不溶性(包涵体)状态存在于细胞质中;或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质,甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条
8、件分泌型异源蛋白的表达以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点:目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中,其稳 稳定性大约是在细胞质中的10倍目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有 甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时,蛋白质 N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠 杆菌的信号肽编码序列重组在一起,一旦分泌型表达,其N端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去分泌型异源蛋白的表达以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的缺点:相对其它生物细胞而言,大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌
9、中进行分泌型表达,少数外源基因既便能分泌表达,但其表达率通常要比包涵体方式低很多,因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有,但并不普遍分泌型异源蛋白的表达蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠,分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联,因此与包涵体相比,分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象,生物活性的回收率增加,且对蛋白酶不敏感 分泌型异源蛋白的表达分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白(细菌素)分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释
10、放蛋白,它激活定位于内上的磷酸酯酶,导致细菌内外膜的通透性增大。因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。融合型异源蛋白的表达 除了直接表达异源蛋白外,还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起,并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中,通常受体细菌的蛋白部分位于N端,异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引
11、入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点,可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白融合型异源蛋白的表达以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件 胞内形成良好的空间构象,且大多具有水溶性 目的蛋白。在实际生产中,产品主要的成本往往就在该工段 行亲和层析,可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在,融合蛋白往往能在目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离,才能获融合型异源蛋白的表达融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表
12、达质粒的构建原则:受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要,它直接决定着为目的蛋白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游,为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下,并不需要完整的受体结构基因,目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近,融合蛋白的裂解工艺两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 融合型异源蛋白的表达融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白:谷胱甘肽转移酶(GST)维持良好空间构象硫氧化还原蛋白(TrxA)维持良好空间构象 pTrxFus麦芽糖结合蛋白(MBP)促进分
13、泌金黄色葡萄球菌蛋白A(SAPA)免疫亲和层析 pRIT2T外膜蛋白(OmpF)促进分泌b-半乳糖苷酶(LacZ)免疫亲和层析泛素蛋白(Ubi)维持良好空间构象融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收 融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性,如果将之注入人体还会导致免疫反应,因此在制备和生产药用目的蛋白时,将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种:化学断裂法 酶促裂解法 融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰(CNBr)它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应,生成溴化亚氨内酯,后者
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