新型诊断技术和应用课件.ppt

1、新型诊断技术与应用新型诊断技术与应用主要技术主要技术Realtime-PCR差异显示PCRRFLPPCR-SSCPFISH基因芯片一、定量一、定量PCR对对DNA或或RNA样本的靶序列进行定量分析。样本的靶序列进行定量分析。主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等在定量在定量PCR反应体系中，除了常规反应体系中，除了常规PCR反应所反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是常用的内参照基因是-肌球蛋白基因肌

2、球蛋白基因荧光定量荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时），又称实时PCR，是目前较精，是目前较精确的进行定量检测确的进行定量检测PCR的方法的方法FQ-PCR通过荧光信号对通过荧光信号对PCR过程中产物量进过程中产物量进行实时监测，行实时监测，精确计算出精确计算出PCR的初始模板量的初始模板量荧光信号的检测方法：荧光信号的检测方法：1、DNA结合染料技术结合染料技术2、水解探针技术（、水解探针技术（TaqMan probe）技术）技术3、杂交探针技术、杂交探针技术TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable D

3、NA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ5353TaqManTMExtension Step531.Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52.Cleavage3.PolymerizationComplete53QTaqR354.Detection533QTaqR5l lR53RQ实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用 CEA 基因

4、在消化系统上皮腺癌，尤其是直结肠癌和胃癌中高表达，因此在肿瘤细胞内可检测到其转 录本，而在正常成人体内极少表 达。正常成人体内CEA基因表达胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达 在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、特异的技术检测到这些肿瘤细胞 中CEA基因的转录本，是发现肿 瘤早期转移的关键。胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达二、差异显示二、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR）一种以逆转录一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差为基础的研究基因表达差异的技术。异的技术。DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗主要用于肿瘤和多种疾

5、病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。的方法。差异显示差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR)RT-PCR(Differential display RT-PCR)三、三、PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对产物含有该突变序列

6、。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。RFLPRFLP诊断镰状细胞贫血诊断镰状细胞贫血四、PCR-SSCP-Single Strand -Single Strand Conformation Polymorphism,Conformation Polymorphism,单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成。突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不

7、同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA 不同顺序 不同构象 不同电泳行为PCR-SSCP 的应用的应用1.基因点突变的监测基因点突变的监测2.多态性检测多态性检测 3.外显子的筛查外显子的筛查 4.cDNA筛查筛查 PCR-SSCP与与RFLP比较比较 无需特殊的限制性内切酶作用无需特殊的限制性内切酶作用可测出理论上任何一个碱基突变位点可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂电泳条件的电泳条件的 改变容易影响改变容易影响SSCP五、五、PCR产物的序列分析产物的序列分析（DNA sequencing）主要见于分子克隆时对于目的

8、基因扩 增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时 分析扩增片段中点突变的位置和性质。可将产物纯化后作为模板直接测序，也可将PCR产物克隆入载体后再测序，后 者测序的效果更好，常用T-A克隆。Sanger测序技术：测序技术：以待测序列的单链以待测序列的单链DNA作为模板，加入作为模板，加入一个引物和一个引物和dNTP作为底物，并加入一作为底物，并加入一定比例的定比例的2，3-ddNTP，在，在DNA聚合酶聚合酶的作用过程中，正常的作用过程中，正常dNTP的掺入使链的掺入使链延伸，若延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种样就可以得到一系列长度不同的

9、以四种ddNTP结尾的结尾的DNA片段，经电泳后可直片段，经电泳后可直接读出碱基序列。接读出碱基序列。PCR测序演示版测序演示版12PCR技术在分子诊断中的应用技术在分子诊断中的应用PCR技术在分子诊断中的应用感染性疾病中病原微生物核酸的检测单基因遗传性疾病的基因诊断多基因病相关基因的检测肿瘤相关基因的检测移植配型和法医学上的应用一、感染性疾病的分子诊断 定性或定量检测致病微生物的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染 的诊断。动态、定量地检测病原体核酸能对 疗效判断和病情预后提供客观的依 据。SARS相关冠状病毒的分子诊断 20032003年年4 4月，香港研究者月，香港研究者PeirisPe

10、iris等报等报 告了告了50 50 例例SARSSARS病人的临床表现和病人的临床表现和 病毒学研究结果证明，新冠状病毒病毒学研究结果证明，新冠状病毒 可能是可能是SARSSARS的致病原因。的致病原因。（Lancet,2003,361:9365)Lancet,2003,361:9365)其它实验室陆续得出相同结论。其它实验室陆续得出相同结论。2003年4月，德国汉堡Bernhard-Nocht热带医学研究所学者 Drosten 等用随机扩增技术，获得长度为 300 bp的核苷酸序列。根据这段序列，建立了检测新冠状 病毒的常规和实时定量PCR技术。（.org on April 10,2003

11、）引物和探针 BNIoutS2-BNIoutAs BNI-1片段，189 bp BNIinS-BNIinAs BNI-1片段的内套片段，108bp BNITMSARS1BNITMSARAs2 BNITMSARP(荧光素标记的探针）产物长度：77 bp 检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺 泡灌洗液、血浆、粪便。检测方法 1.逆转录-巢式PCR 2.逆转录-实时PCR结 果 病人和接触者（具临床症状）的痰 液中用外套引物检测到了病毒。病人的其它标本用套式PCR检测到 病毒。有报道显示，在可能SARS病人 中，病毒的检出率为100%。在疑似SARS病人中的检出率为 23%。所有健康接触者中未检

12、测到病毒。检测病毒的3种方 法（血清学检测、病毒分离、PCR技术）中，PCR技 术的检出率最高。疾病的早期即可获得阳性结果（早 于血清转换期）。特异性较高（SARS患者中的阳性 率约为80%，对照中的阴性率约为 98%100%）。现有的方法敏感性较差，阴性结果 不能排除病毒感染。其他感染性疾病的诊断其他感染性疾病的诊断HBV病毒病毒HIV病毒病毒.二、单基因疾病的诊断二、单基因疾病的诊断 单基因遗传病是由于某一基因结 构的变化或由其而引起的基因表 达异常所导致的疾病，因此用分 子生物学技术检测致病基因的遗 传缺陷是诊断这些疾病最根本的 手段。2、DMD的分子诊断的分子诊断X染色体连锁隐性遗传性

13、肌肉疾病，发病率 为1/3 500个男孩DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2500Kb DMD基因的突变导致dystrophin缺陷检测DMD基因的技术：Southern印迹、PCR-SSCPDMD的基因检测是一种高发病率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗 传性疾病，在2500个活产男婴中即有一个患者。致病基因DMD的全长为250kb，有79个外 显子。DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%70%。DMD基因外显子缺失的检测PCR-SSCP检测非缺失型DMD C C 母母 子子 肢带型肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy,LGMD）是一组累

14、及肩胛、骨盆带 和四肢近端肌肉的遗传性疾病。LGMD1：显性遗传（1A、1B、1C）LGMD2：隐性遗传（2A2H）不同类型的LGMD不仅在遗传学上具高度异质 性（不同致病基因，不同基因突变），临床表 现亦十分不一致，临床诊断和分类十分困难。LGMD2B的基因定位和遗传缺陷的研究的基因定位和遗传缺陷的研究 诊断标准：LGMD的诊断必须符合以下2个标准之一：1.致病基因与已知的某一LGMD基因位点 连锁 2.检测到致病基因编码产物的缺陷先证者先证者 男性，男性，56岁。岁。初中时发觉体育活动受限，且无法踮脚站立。初中时发觉体育活动受限，且无法踮脚站立。以后症状逐渐加重，并伴有下肢肌肉萎缩。四以后

15、症状逐渐加重，并伴有下肢肌肉萎缩。四 年前来我院就诊时已无法行走，四肢肌肉萎缩年前来我院就诊时已无法行走，四肢肌肉萎缩 明显，尤以双侧小腿为甚。肌电图示肌源性损明显，尤以双侧小腿为甚。肌电图示肌源性损 害，害，CK值值3倍高于正常范围。倍高于正常范围。家系资料致病基因编码产物检测结果先证者LGMD2B基因的编码蛋白dysferlin 条带密度与正常对照相比有明显下降，其余各蛋白条带与正常对照相比无明显改变。免疫荧光检测骨骼肌dysferlin C PDYSF基因突变的检测 在DYSF基因的突变热点区筛查，以期 找出导致 dysferlin缺陷的基因突变。逆转录PCR 产物作序列分析GDYSF基

16、因检测结果 cDNA第6425/6426位(52号外显子)缺失 1个G碱基(6425/6426 del G)。第2019位密码子agg agc，下游读码 发生移码突变，使第2035位密码子 atg tga(53号外显子，M 2035 X)。终止密码的提前产生是 dysferlin缺陷的 原因。是尚未报道的一个新突变，也是中国第 一例DYSF基因突变。根据患者病史、体征和分子诊断实验结 果，这是一个由于 DYSF 基因突变造成 相应编码产物缺陷而导致的疾病。三、多基因病的分子诊断三、多基因病的分子诊断 多基因病具一定的遗传因素，家庭 发病率高于人群发病率，但是疾病 的产生都以一定的环境条件为诱因

17、，遗传因素在其中所起作用程度各异。多基因病中的遗传因素是若干个 易感基因微小作用的累加，某一 易感基因结构的变化不足以导致 疾病的产生。人类基因组多态性是多基因病基因 诊断的基础，易感基因多态性的检 测能帮助我们理解多基因病发生的 机制，有助于对疾病的诊断和分类。高血压候选基因多态性分析的应用前景 临床分型 靶器官损伤 个体化治疗基因多态性与盐敏感性高血压基因多态性与盐敏感性高血压 -内收素 血管紧张素转换酶 上皮钠通道血管紧张素原 心钠素2肾上腺素能受体 SAG蛋白亚单位3ACE基因多态性基因多态性与高血压靶器官损伤与高血压靶器官损伤疾病 研究报告数 I D D D冠心病 30 +11%+3

18、2%心肌梗死 15 +12%+39%脑卒中 5 +22%+94%高血压肾病 19 +10%+53%糖尿病肾病 11 +40%+56%*与II型相比，DD型和ID型发生上述疾病的危险性增高程度 (145个ACE基因I/D多态性研究49959例的荟萃分析）基因多态性与高血压靶器官损伤基因多态性与高血压靶器官损伤脑卒中 载脂蛋白E -纤维蛋白原 血管紧张素原 血管紧张素II的1型受体 内皮型一氧化氮合酶 心钠素冠心病 副氧酶 凝血因子V 凝血因子VII 载脂蛋白BTOHP试验中的试验中的AGT基因研究基因研究目的目的：观察观察AGT基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的

19、 血压变化和高血压发病率间的关系血压变化和高血压发病率间的关系对象对象：1509例例基因分析基因分析：AGT基因基因G-A多态性多态性结果结果：对照组对照组 限盐组限盐组 减轻体重组减轻体重组 AA型型 45 28 25 GG型型 32 41 32 Hunt SC,et al:Hypertension,1998;32:393-401基因多态性分析基因多态性分析指导抗高血压药物的选择指导抗高血压药物的选择 药物种类药物种类 基因基因 利尿剂 -内收素 ACE抑制剂 ACE、AT1 -受体阻滞剂 G蛋白（Gs)六、FISH FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using Flyorescene microscopy.七、生物芯片生物芯片技术在今后的多基因病的生物芯片技术在今后的多基因病的的发病机制研究、诊断和治疗等方的发病机制研究、诊断和治疗等方面将发挥越来越显著的作用面将发挥越来越显著的作用