新编第3章蛋白质课件.ppt

1、蛋白质的生物学意义1.生物体的组成成分2.酶3.运输4.运动5.抗体6.干扰素7.遗传信息的控制8.细胞膜的通透性9.高等动物的记忆、识别机构木瓜蛋白酶一、蛋白质的化学组成一、蛋白质的化学组成l蛋白质分子量的上下限是人为蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。分子量概念的定义。l某些蛋白质是由两个或更多个某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基蛋白质亚基(多肽链多肽链)通过非共价通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。百万甚至数千万。根据蛋白

2、质来源的不同，蛋白质可分为主要来源于肉类、乳类和蛋类。肉类蛋白质：约含有70%的结构蛋白和30%的水溶性蛋白质。水溶性蛋白质又可分为肌浆蛋白和肌清蛋白两种。乳类蛋白质：乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白和脂肪球膜蛋白质。蛋类蛋白质：蛋类蛋白质包括蛋清、蛋黄蛋白质两类。：主要是来源于蔬菜、谷物和油料种子中的蛋白质。蔬菜蛋白，谷类蛋白,油料种子蛋白。单细胞蛋白质来源于微生物。在酵母菌中可达40%60%，细菌中甚至可达80%以上。单细胞蛋白质特点是核蛋白含量高，目前主要用于饲料生产。氨基酸氨基酸 是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种基本氨基酸（20 standard amino aci

3、ds)组成。1 1、氨基酸的结构通式：、氨基酸的结构通式：19种氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到碳原子（C），同时结合到（C）上的是H原子和各种侧链（R）；脯氨酸（Pro）具有二级氨基（-亚氨基酸）不带电形式 H2NCHCOOHR +H3NCHCOO-R两性离子形式C C 如是不对称C（除Gly），则：具有两种立体异构体 D-型和L-型1.2.具有旋光性 左旋（-）或右旋（+）甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸缬氨酸缬氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸丝氨酸丝氨酸半胱氨酸半胱氨酸苏氨酸苏氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸脯脯 氨酸氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸天冬氨酸天冬氨酸酪氨酸酪氨酸色氨酸色氨酸组氨

4、酸组氨酸赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸谷氨酸谷氨酸天冬酰胺天冬酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺苯丙氨酸苯丙氨酸 根据侧链根据侧链R的性质不同，可将氨基酸分为四类：的性质不同，可将氨基酸分为四类：非极性或疏水性氨基酸、极性不带电荷氨基酸、在非极性或疏水性氨基酸、极性不带电荷氨基酸、在pH7.0时时R带负电荷氨基酸和在带负电荷氨基酸和在pH7.0时时R带正电荷带正电荷氨基酸。氨基酸。非极性或疏水性氨基酸和极性不带电荷氨基酸非极性或疏水性氨基酸和极性不带电荷氨基酸是是中性氨基酸中性氨基酸，在，在pH7.0时时R带负电荷氨基酸为带负电荷氨基酸为酸性酸性氨基酸氨基酸，在，在pH7.0时时R带正电荷氨基酸为带正电荷氨基酸为

5、碱性氨基酸碱性氨基酸。COO-CHH3N+RCOO-CHH2NR-pK1+H+H+COOHCHH3N+RH+H+pK2-正离子 两性离子 负离子酸性溶液酸性溶液 水溶液水溶液 （pHpHpIpI）（pH=pIpH=pI）碱性溶液碱性溶液（pHpHpIpI）氨基酸的甲醛滴定法RCHCOOHNH2HCHORCHCOOHNHCH2OHHCHORCHCOOH N(CH2OH)2氨基酸氨基酸氨基酸的二羟甲基衍生物氨基酸的二羟甲基衍生物+碱碱中和滴定中和滴定氨基酸的二羟甲基衍生物氨基酸的二羟甲基衍生物（4 4）茚三酮反应）茚三酮反应 所有氨基酸及具有游离所有氨基酸及具有游离-氨氨基的肽与茚三酮反应都产生基

6、的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生羟脯氨酸与茚三酮反应产生（亮）黄色物质。（亮）黄色物质。此反应是此反应是氨基酸的特异性反应，常用氨基酸的特异性反应，常用于氨基酸的定性或定量分析。于氨基酸的定性或定量分析。定量释放的定量释放的COCO2 2可用测压法可用测压法测量，计算出参加反应的氨测量，计算出参加反应的氨基酸量。产生的蓝紫色化合基酸量。产生的蓝紫色化合物可用比色法进行定性或定物可用比色法进行定性或定量测定。量测定。（5 5）桑格反应（）桑格反应（2,4-2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)反应）反应）NO2FO2N+

7、HNCHCOOHRNO2O2NHNCHCOOHR+HF弱碱性DNP-氨基酸（）DNFB首先由首先由SangerSanger应用，确定了胰岛素的一级结构应用，确定了胰岛素的一级结构A.A.肽分子与肽分子与DNFBDNFB反应，得反应，得DNP-DNP-肽。肽。B.B.水解水解DNP-DNP-肽，得肽，得DNP-NDNP-N端氨基酸及其他游离氨端氨基酸及其他游离氨基酸。基酸。C.C.分离分离DNP-DNP-氨基酸。氨基酸。D.D.层析法定性层析法定性DNP-DNP-氨基酸，得出氨基酸，得出N N端氨基酸的种端氨基酸的种类、数目。类、数目。由由EdmanEdman于于19501950年首先提出。年首

8、先提出。为为-NH-NH2 2的反应。的反应。用于用于N N末端分析，又称末端分析，又称EdmanEdman降解法。降解法。（6 6）艾德曼（）艾德曼（Edman)Edman)反应反应 在弱碱性条件下，氨基酸的在弱碱性条件下，氨基酸的-氨基可与苯异硫氰酸（氨基可与苯异硫氰酸（PITG）反应）反应生成相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（简称生成相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（简称PTC-氨基酸）。在酸性条件下，氨基酸）。在酸性条件下，PTC-氨基酸环化形成在酸中稳定的苯乙内酰硫脲氨基酸（简称氨基酸环化形成在酸中稳定的苯乙内酰硫脲氨基酸（简称PTH）。）。蛋白质多肽链蛋白质多肽链N-末端氨基酸的末端氨基酸的-氨基

9、也可有此反应，生成氨基也可有此反应，生成PTC-肽，在肽，在酸性溶液中释放出末端的酸性溶液中释放出末端的PTH-氨基酸和比原来少一个氨基酸残基的多氨基酸和比原来少一个氨基酸残基的多肽链。肽链。PTH-氨基酸在酸性条件下极稳定并可溶于乙酸乙酯，用乙酸乙氨基酸在酸性条件下极稳定并可溶于乙酸乙酯，用乙酸乙酯抽提后，经高压液相层析鉴定就可以确定肽链酯抽提后，经高压液相层析鉴定就可以确定肽链N-末端氨基酸的种类。末端氨基酸的种类。该法的优点是可连续分析出该法的优点是可连续分析出N端的十几个氨基酸。瑞典科学家端的十几个氨基酸。瑞典科学家P.Edman首先使用该反应测定蛋白质首先使用该反应测定蛋白质N-末端

10、的氨基酸。氨基酸自动顺序分析仪就末端的氨基酸。氨基酸自动顺序分析仪就是根据该反应原理而设计的。是根据该反应原理而设计的。NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR1苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯肽肽苯异硫腈氨基酸衍生物苯异硫腈氨基酸衍生物（PTH氨基酸）氨基酸）裂解裂解重排重排+NH2CHCOR2+少一个氨基酸残基的肽少一个氨基酸残基的肽谷氨酸谷氨酸甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸赖氨酸赖氨酸CCNCCNCCNCCNCC H2C HC H2C H2C H2C O O-O HC O2HC H2C O N H2

11、O HC H3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnC H3N-端C-端肽键 多肽是由氨基酸以肽键连接而成，因此，多多肽是由氨基酸以肽键连接而成，因此，多肽可以发生氨基酸的一切反应。如两性解离。但解肽可以发生氨基酸的一切反应。如两性解离。但解离情况较为复杂。离情况较为复杂。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点胰蛋白酶胰蛋白酶NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点胃蛋白酶胃蛋白酶NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点嗜热菌蛋白酶

12、嗜热菌蛋白酶NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点羧肽酶和氨肽酶羧肽酶和氨肽酶多肽链上的多肽链上的-碳原子均为碳原子均为L-L-构型。在一定条件下，构型。在一定条件下，可转化为可转化为D-D-构型。这种构型的转化是通过烯醇化实构型。这种构型的转化是通过烯醇化实现的。现的。消旋化速率与氨基酸的结构和反应条件相关，消旋化速率与氨基酸的结构和反应条件相关，当氨基酸残基侧链含有吸电子基团时，消旋化的速当氨基酸残基侧链含有吸电子基团时，消旋化的速率大大加快。碱性和高温有利于消旋化。率大大加快。碱性和高温有利于消旋化。1 1、谷胱甘肽、谷胱甘肽(glutath

13、ione,GSH)(glutathione,GSH)谷胱甘肽也叫谷胱甘肽也叫-谷氨酰谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，广泛存在于生物细胞中。半胱氨酰甘氨酸，广泛存在于生物细胞中。GSHGSH分子中含有活分子中含有活性的硫氢基（巯基），极易被氧化。氧化时，两分子还原型性的硫氢基（巯基），极易被氧化。氧化时，两分子还原型GSHGSH以二硫键结合成氧化型以二硫键结合成氧化型GSHGSH。GSHGSH的还原型和氧化型的的还原型和氧化型的转变是可逆的。转变是可逆的。还原型GSH 氧化型GSHGSHGSH在生物体内发生的氧化还原反应中起重要的作用，它可在生物体内发生的氧化还原反应中起重要的作用，它可以抵抗体内生产的过

14、多的以抵抗体内生产的过多的H H2 2O O2 2和外源性氧化剂，起到保护蛋和外源性氧化剂，起到保护蛋白质巯基免遭氧化，维持蛋白质生理功能的作用。白质巯基免遭氧化，维持蛋白质生理功能的作用。C y sT y rI L eG l nA s nC y sP r oL e uG l yN H2SS牛 催 产 素C y sT y rG l nA s nC y sP r oSSP h eA r gG l yN H2牛 加 压 素 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽2 2、脑啡肽、脑啡肽3 3、催

15、产素和加压素、催产素和加压素SS牛胰岛素的化学结构牛胰岛素的化学结构HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr Leu-Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB B链链157101519 20212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A A链链711621SSSSl1 1，样品必需纯（，样

16、品必需纯（97%97%以上）；以上）；l2 2，知道蛋白质的分子量；，知道蛋白质的分子量；l3 3，知道蛋白质由几个亚基组成；，知道蛋白质由几个亚基组成；l4 4，多肽链的拆分。，多肽链的拆分。l5 5，测定多肽链的氨基酸组成。，测定多肽链的氨基酸组成。l6 6，测定多肽链的氨基酸顺序。，测定多肽链的氨基酸顺序。1作用：作用：这些反应可用于巯基的保护这些反应可用于巯基的保护。-OOCCHCH2SHNH3+CH2OCClO-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2ClCH2-OOCCHCH2SNH3+ICH2CNH2OCH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+O2NFNO2+H2NCHCR

17、OHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SC

18、N CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR1异硫氰酸苯酯（i）胰蛋白酶裂解多肽链；（）V8蛋白酶的裂解；（iii）Edman降解法测定胰蛋白酶裂解的肽片段（T1T3）和V8蛋白酶裂解的肽片段（V1V3）的氨基酸序列；（）根据重叠肽段组装完整的全长序列肽链.多肽链折叠、盘曲，形成特有而稳定的三维空间结构。多肽链折叠、盘曲，形成特有而稳定的三维空间结构。具有空间结构的蛋白质才有生物功能。具有

19、空间结构的蛋白质才有生物功能。研究蛋白质空间结构最有效的方法是研究蛋白质空间结构最有效的方法是X X射线衍射法射线衍射法。近。近年来，年来，高分辨核磁共振技术高分辨核磁共振技术在蛋白质的空间结构研究中获得在蛋白质的空间结构研究中获得了广泛应用。了广泛应用。蛋白质分子中各原子和基团在三维空间所处的相对位置蛋白质分子中各原子和基团在三维空间所处的相对位置构成的特定空间结构，称为构成的特定空间结构，称为蛋白质的构象（蛋白质的构象（protein protein conformationconformation）。）。天然蛋白质分子都有与其生物活性密切相关的一种或几天然蛋白质分子都有与其生物活性密切相

20、关的一种或几种特定构象。蛋白质构象十分复杂，可分为二级结构、三级种特定构象。蛋白质构象十分复杂，可分为二级结构、三级结构和四级结构。具有生物功能的完整蛋白质必定具有三级结构和四级结构。具有生物功能的完整蛋白质必定具有三级甚至四级结构。甚至四级结构。（secondary structuresecondary structure）组成肽键的原子处于同一平面。组成肽键的原子处于同一平面。在肽链中，称为肽平面。两个相在肽链中，称为肽平面。两个相邻肽键通过一个共同的邻肽键通过一个共同的-碳原子相碳原子相连接。连接。C-N键和键和C-C键可以自由键可以自由旋转，因此，在保持肽键平面结旋转，因此，在保持肽键

21、平面结构不变条件下，能够形成不同的构不变条件下，能够形成不同的空间排列。空间排列。绕绕C-N键旋转的角度称键旋转的角度称（角），经（角），经C-C键旋转的角度称键旋转的角度称为为（角）。原则上，（角）。原则上，和和可以可以取取-180+180之间的任意值之间的任意值（=0，=0的构象不存在）。的构象不存在）。蛋白质二级结构主要有蛋白质二级结构主要有-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角和自由肽段。转角和自由肽段。左手和右手螺旋左手和右手螺旋天然蛋白质中存在的天然蛋白质中存在的-螺旋主要是右手螺旋，既螺旋的走向螺旋主要是右手螺旋，既螺旋的走向为顺时针方向。为顺时针方向。在在-折叠中，折叠中，-碳原子

22、总是处于折叠的角上，氨基酸的碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为的轴心距为0.35nm0.35nm；N CHCC2CHNHO=C3CHNC CHNRRHOHRROHO自由肽段自由肽段蛋白质结构中无规则的肽段，多与蛋白质的功蛋白质结构中无规则的肽段，多与蛋白质的功能有关。没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。能有关。没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。蛋白质二级结构：蛋白质二级结构：-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转转角和自由肽段。角和自由肽段。、结构域、结构域（Edelman,

23、1970)Edelman,1970)对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域结构域。结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域一般由结构域一般由100200 100200 个氨基酸残基组成，但大小范围可达个氨基酸残基组成，但大小范围可达

24、40400 40400 个个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上的活性中心往往位于两个结构域的界面上结构域之间由结构域之间由“铰链区铰链区”相连，使分子构象相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进在蛋白质分子内，结构域可作为结构

25、单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性稳定的结构，甚至保留某些生物活性磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构 a a盐键（离子键盐键（离子键 ）b b氢键氢键 c c疏水相互作用力疏水相互作用力 d d 范德华力范德华力 e e二硫键二硫键 f f 酯键酯键abcecdda血红蛋白血红蛋白(hemoglobin)的四级结构的四级结构蛋白质分子中的共价键与次级键蛋白质分子中的共价键与次级键 一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三三级结构级结构亚基亚基四级结构四级结

26、构共价共价键键次级次级键键化学键化学键 肽键肽键一级结构一级结构氢键氢键二硫键二硫键二、三、四级结构二、三、四级结构疏水键疏水键盐键盐键范德华范德华力力三、四级结三、四级结构构蛋白质分子中的共价键与次级键蛋白质分子中的共价键与次级键离子键离子键氢键氢键范德华力范德华力疏水相互作用力疏水相互作用力（一）蛋白质一级结构与功能的关系（一）蛋白质一级结构与功能的关系 蛋白质一级结构的改变有可能影响它的功能，有些改变蛋白质一级结构的改变有可能影响它的功能，有些改变甚至引起其功能的完全丧失。而一级结构的改变能否影响其甚至引起其功能的完全丧失。而一级结构的改变能否影响其生物功能，关键是看这种改变是否引起了构

27、象的改变。生物功能，关键是看这种改变是否引起了构象的改变。进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。（sick-cell anemia）患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-SHb-S），），它与正常的血红蛋白（它与正常的血红蛋白（Hb-AHb-A）的差别：仅仅在于）的差别：仅仅在于 链的链的N-N-末端第末端第6 6位残基发生了变化。位残基发生了变化。（Hb-AHb-A）第）第6 6位残基是极性谷

28、氨酸残基，（位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-SHb-S）中换）中换成了非极性的缬氨酸残基，使血红蛋白细胞收缩成镰刀成了非极性的缬氨酸残基，使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血。形，输氧能力下降，易发生溶血。这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性。这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性。体内的某些蛋白质分子初合成时，体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子的方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比例：胰

29、岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为肽，称为前胰岛素原前胰岛素原前胰岛素原前胰岛素原的的N-N-末端有一段肽链，称末端有一段肽链，称为信号肽为信号肽.信号肽被切去，剩下的是信号肽被切去，剩下的是胰岛素原胰岛素原。胰岛素原胰岛素原比胰岛素分子多一段比胰岛素分子多一段C C肽，肽，只有当只有当C C肽被切除后才成为有肽被切除后才成为有5151个残基，个残基，分分A A、B B两条链的胰岛素分子单体两条链的胰岛素分子单体.同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构

30、中有许多位置的氨基酸对所有种属来同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基基.不同种属的可变残基有很大变化不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘可用于判断生物体间亲缘关系的远近关系的远近.例：细胞色素例：细胞色素C Cl60 60 个物种中，有个物种中，有 27 27 个位置上的氨基酸残基完全不变，是维个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基.l可变残基可能随着进化而变异，而且

31、不同种属的细胞色素可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素 C C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）氨基酸差异少，反之则多（进化树）.一些物理因素（如加热、加压、射线等）和化学因一些物理因素（如加热、加压、射线等）和化学因素（如强酸、强碱和有机溶剂等）会破坏蛋白质的空间素（如强酸、强碱和有机溶剂等）会破坏蛋白质的空间结构，导致蛋白质生物活性的丧失，同时引起某些物理结构，导致蛋白质生物活性的丧失，同时引起某些物理化学性质的变化，如溶解度降低、发生沉淀等，这类现化学性质的变化，如溶解

32、度降低、发生沉淀等，这类现象叫象叫。变性蛋白质和天然蛋白质在一级结构上相同，只是变性蛋白质和天然蛋白质在一级结构上相同，只是空间结构发生改变，因而生物活性随之丧失。空间结构发生改变，因而生物活性随之丧失。在有些情况下，变性作用是可逆的，只要除去变性在有些情况下，变性作用是可逆的，只要除去变性因素，蛋白质的空间结构还可逐渐恢复，重新恢复其生因素，蛋白质的空间结构还可逐渐恢复，重新恢复其生物活性。变性蛋白质分子恢复其天然形式，称为物活性。变性蛋白质分子恢复其天然形式，称为复性复性。蛋白质的热变性是因为在较高的蛋白质的热变性是因为在较高的温度下，保持蛋白质空间结构的次级温度下，保持蛋白质空间结构的次

33、级键断裂，破坏了肽键特定的空间排列，键断裂，破坏了肽键特定的空间排列，原来在分子内部的一些非极性疏水侧原来在分子内部的一些非极性疏水侧链暴露到分子表面，因而降低了蛋白链暴露到分子表面，因而降低了蛋白质分子的溶解度，促进蛋白质分子间质分子的溶解度，促进蛋白质分子间相互结合而凝聚，继而形成不可逆的相互结合而凝聚，继而形成不可逆的凝胶而凝固沉淀。凝胶而凝固沉淀。蛋白质热变性的机理：蛋白质热变性的机理：思考题：思考题：如何辩证的看待蛋白质的变如何辩证的看待蛋白质的变性和凝固作用（从生命现象、人性和凝固作用（从生命现象、人类生活和生产各方面考虑）？类生活和生产各方面考虑）？多亚基蛋白质（四级结构）中的一

34、个亚基空间结构的多亚基蛋白质（四级结构）中的一个亚基空间结构的改变会引起其它亚基空间结构的改变，从而使蛋白质功能改变会引起其它亚基空间结构的改变，从而使蛋白质功能和性质发生一定的改变，叫和性质发生一定的改变，叫蛋白质空间结构与功能的关系举例：蛋白质空间结构与功能的关系举例：1、折叠病。、折叠病。2、疯牛病。、疯牛病。正常蛋白质正常蛋白质朊病毒朊病毒未知因素疯牛病疯牛病侵侵入入牛牛脑脑蛋白蛋白质构质构象改象改变变 蛋白质相对分子量在蛋白质相对分子量在10 0001 000 00010 0001 000 000之间。测定分子量之间。测定分子量的主要方法有的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、

35、聚丙烯酰渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳等。等。（SvedbergSvedberg于于19401940年设计）年设计）蛋白质颗粒在蛋白质颗粒在60 00060 00080 000r/min80 000r/min的高速离心力作用下，的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动，用光学方法测定蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动，用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。蛋白质的沉降。蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关。速度与分子大小和形状有关。沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用沉降系数是溶质颗

36、粒在单位离心场中的沉降速度，用S S表示。表示。一个一个S S单位，为单位，为1 11010-13-13秒秒相对分子质量越大，相对分子质量越大，S S值越大值越大蛋白质的沉降系数：蛋白质的沉降系数：1 1200S200S s=v2x v v=沉降速度（沉降速度（dx/dtdx/dt）=离心机转子角速度（弧度离心机转子角速度（弧度/s/s）x x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（蛋白质界面中点与转子中心的距离（cmcm）蛋白质分子量（蛋白质分子量（MM）与沉降系数（）与沉降系数（s s）的关系：）的关系：M=RTsD（1V）R气体常数（8.314107ergsmol-1 度-1）T绝对温度D扩散

37、常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V蛋白质的微分比容（m3g-1）溶剂密度（20，gml-1）s沉降系数2.2.凝胶过滤法凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。大分子则被排阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。网

38、状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：SephadexSephadex。测得几种标准蛋白质的洗测得几种标准蛋白质的洗脱体积。脱体积。从标准曲线上可查出样品从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。蛋白质的相对分子质量。3.SDS-3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂。十二烷基硫酸钠，变性剂。普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）。净电荷、大小、形状）。用用SDSSDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理

39、，蛋白质变性（肽链伸展）和巯基乙醇（打开二硫键）处理，蛋白质变性（肽链伸展）并与并与SDSSDS结合，形成结合，形成SDS-SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。不同蛋白质分子的均带负电（不同蛋白质分子的均带负电（SDSSDS带负电）；且荷质比相同（蛋带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合白质分子大，结合SDSSDS多；分子小，结合多；分子小，结合SDSSDS少）少）不同蛋白质分子具有相似的构象。不同蛋白质分子具有相似的构象。用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图。用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图。测出待测样品的迁移率。测出待测样品的迁移率。从标准曲线上

40、查出样品的相对分子质量。从标准曲线上查出样品的相对分子质量。影响迁移率的主要因素影响迁移率的主要因素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产产 生不同的阻力主要因素生不同的阻力主要因素凝胶的浓度和交联度凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小者，迁移率小 优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品 缺点：误差大，约为缺点：误差大，约为1010（误差主要来源于迁移距离（误差主要来源于迁移距离的测量误差）

41、的测量误差）此方法只能测得此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量亚基肽链的相对分子质量+-+1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。+5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电+由于蛋白质的分子量很大，蛋白质溶液的摩尔浓度一般是很小的。由于蛋白质的分子量很大，蛋白质溶液的摩尔浓度一般是很小的。所以蛋白质溶液的渗透压很低。所以蛋白质溶液的渗透压很低。将混有小分子化合物（如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、短肽以及表将混有小分子化合物（如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、短肽以及表面

42、活性剂等）的蛋白质溶液盛入半透膜内放入透析液（通常为蒸馏水或面活性剂等）的蛋白质溶液盛入半透膜内放入透析液（通常为蒸馏水或缓冲液）中，由于蛋白质分子体积大，不能透过半透膜，而溶液中的其缓冲液）中，由于蛋白质分子体积大，不能透过半透膜，而溶液中的其他小分子物质则能透过半透膜进入透析液中，从而使蛋白质与小分子物他小分子物质则能透过半透膜进入透析液中，从而使蛋白质与小分子物质完全分开，这个分离过程叫质完全分开，这个分离过程叫（Dialysis）。）。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料。此法是蛋白质分离纯化中常用的简便方法之一。此法是蛋白质分离纯化中常用的简便方

43、法之一。蛋白质溶液稳定的原因：蛋白质溶液稳定的原因：1 1）表面形成水膜（水化层）；）表面形成水膜（水化层）；2 2）带相同电荷（双电层）带相同电荷（双电层）。1.1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2.2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。（1 1）纸上电泳：用滤纸作支持物。）纸上电泳：用滤纸作支持物。（2 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。烯酰胺）作支持物。

44、1 1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2 2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。的电泳。因此，蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相因此，蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，水膜和电荷一旦被除去时，对的。假若改变环境条件，水膜和电荷一旦被除去时，蛋白质就会聚集在一起而形成较大的蛋白质团，最后从蛋白质就会聚集在一起而形成较大的蛋白质团，最后从溶液中沉淀出来。溶液中沉淀出来。通过向蛋白质溶液中加电解质中和电荷，加脱水通过向蛋白质溶液中加电解质中和电荷，加脱水剂破坏水化层，或调节溶液剂破坏水化层，或调节

45、溶液pHpH值到蛋白质的等电点，值到蛋白质的等电点，都可以引起蛋白质的沉淀都可以引起蛋白质的沉淀。机理：机理：水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等与水亲和力水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等与水亲和力大，能与水以任何比例互溶。当蛋白质水溶液中加大，能与水以任何比例互溶。当蛋白质水溶液中加入适量这类有机溶剂时，它能夺取蛋白质颗粒表面入适量这类有机溶剂时，它能夺取蛋白质颗粒表面的水化膜，同时还能降低水的介电常数，增加蛋白的水化膜，同时还能降低水的介电常数，增加蛋白质颗粒间的静电相互作用，导致蛋白质分子聚集絮质颗粒间的静电相互作用，导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。结沉淀。NaOH、CuSO2或二个以上肽键所有蛋白质HgNO3、HgNO2HNO2及HNO3 Tyr浓HNO3及NH3 Tyr、Phe乙醛酸试剂及浓H2SO4 Trp-萘酚、NaClO胍基Arg碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸酚基、吲哚基Tyr茚三酮自由氨基及羧基-氨基酸