章蛋白质的分离纯化和表征教学用课件.ppt

1、蛋白质的通性、蛋白质的通性、纯化和表征纯化和表征第第 6章章一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定教学内容教学内容一、蛋白质的酸碱性质对某种蛋白质来说，在某一对某种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一好相等，也即净电荷为零，这一pH，蛋白质的，

2、蛋白质的等电点。等电点。蛋白质的等电点A.有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。如子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离、等可与蛋白质某些可解离基团结合，影响等电点。基团结合，影响等电点。B.无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液pH称为等离子点称为等离子点(isoionic point,或称等离点或称等离点)。等离子点是。等离子点是每种蛋

3、白质的一个特征常数。每种蛋白质的一个特征常数。一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定教学内容教学内容二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀(一一)蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质 (二二)蛋白质沉淀蛋白质沉淀A.A.分散相质点在分散相质点在1 1l00 nml00 nm范围内范围内,在动力学上是稳定的在动力学上是稳定

4、的,介质分介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零子对这种质点碰撞的合力不等于零,使它能在介质中作不断的使它能在介质中作不断的布朗运动布朗运动;B.B.分散相质点带有同种符号的净电荷分散相质点带有同种符号的净电荷,互相排斥互相排斥,不易聚集成大颗不易聚集成大颗粒而沉淀粒而沉淀;C.C.分散相质点能与溶剂形成溶剂化层分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成例如与水形成水化层水化层,质点质点有了水化层有了水化层,相互间不易靠拢而聚集相互间不易靠拢而聚集.(一)蛋白质胶体性质分散相质点在胶体系统中保持稳定的分散相质点在胶体系统中保持稳定的3 3个条件个条件:蛋白质溶液蛋白质溶液,稳定的稳定的亲水胶体

5、亲水胶体:亲水基团与水发生亲水基团与水发生水化作用；水化作用；某一某一pHpH下相同电荷。也有丁大尔现象、布朗运动以及不能透下相同电荷。也有丁大尔现象、布朗运动以及不能透过半透膜性质过半透膜性质 蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关,影影响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性：加人响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性：加人脱水脱水剂剂以除去它的水化层；改变溶液的以除去它的水化层；改变溶液的pH达到蛋白质等电点使达到蛋白质等电点使质点的净电荷为零，蛋白质分子则聚集成大的颗粒而沉淀。质点的净电荷为零，蛋白质分子则聚集成大的颗粒而

6、沉淀。(二)蛋白质沉淀沉淀蛋白质的方法有以下几种沉淀蛋白质的方法有以下几种:A.A.盐析法：中性盐盐析法：中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，脱去水化层，脱去水化层而聚集沉淀，蛋白质不变性。而聚集沉淀，蛋白质不变性。B.B.有机溶剂沉淀法：脱去水化层、降低介电常数增加异性电荷有机溶剂沉淀法：脱去水化层、降低介电常数增加异性电荷间的相互作用，蛋白质变性。低温操作，且尽量缩短处理时间的相互作用，蛋白质变性。低温操作，且尽量缩短处理时间则可使变性速度减慢。间则可使变性速度减慢。C.C.重金属盐沉淀法：带负电荷时易与重金属离子结合成不溶性重金属盐沉淀法：带负电荷时易与重金属离子

7、结合成不溶性盐而沉淀。可口服大量牛奶或豆浆等可解重金属盐中毒。盐而沉淀。可口服大量牛奶或豆浆等可解重金属盐中毒。D.D.生物碱试剂和某些酸沉淀法：生物碱试剂和某些酸沉淀法：蛋白质带正电合适与之结合沉蛋白质带正电合适与之结合沉淀。淀。E.E.加热变性沉淀法：加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加加热变性沉淀法：加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固热凝固一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定五、

8、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定教学内容教学内容三、蛋白质分离纯化的一般原则(1)(1)前处理前处理:(2)(2)粗分级分离粗分级分离:(3)(3)细分级分离细分级分离:蛋白质纯化测总目标：增加蛋白质纯化测总目标：增加纯度或比活力纯度或比活力A.A.动物材料剔除结缔组织、脂肪组织动物材料剔除结缔组织、脂肪组织;种子材料应先去壳种子材料应先去壳和种皮以免受单宁等物质的污染和种皮以免受单宁等物质的污染,油料种子脱脂油料种子脱脂.B.B.选择适当方法选择适当方法,破碎组织或细胞：动物组织破碎组织或细胞：动物组织(电动捣碎机电动捣碎机或匀浆器或超声或

9、匀浆器或超声););C.C.植物组织植物组织(英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用纤维素纤维素酶酶););细菌细胞细菌细胞(超声超声,与砂研磨或与砂研磨或溶菌酶溶菌酶).).D.D.选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来.E.E.如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的,用超声波用超声波或去污剂使膜结构解聚或去污剂使膜结构解聚,用适当的介质提取。用适当的介质提取。(1)(1)前处理前处理:(2)(2)粗分级分离粗分级分离:常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时常用盐析、等电点沉

10、淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。可用超过滤或凝胶过滤等方法。(3)(3)细分级分离细分级分离:各种层析、电泳巧妙配合各种层析、电泳巧妙配合,后期可后期可 用结晶法。用结晶法。一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定教学内容教学内容四、蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同根据分子大小

11、不同 利用溶解度差别利用溶解度差别 根据电荷不同根据电荷不同 利用选择性吸附利用选择性吸附 利用对配体的特异生物利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法学亲和力的纯化方法(一一)透析和超过滤透析和超过滤(二二)凝胶过滤凝胶过滤(三三)盐溶和盐析盐溶和盐析(四四)有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法(五五)凝胶电泳和等电聚焦凝胶电泳和等电聚焦(六六)离子交换层析离子交换层析(七七)亲和层析亲和层析(八八)高效液相层析高效液相层析 常用凝胶：交联葡聚糖、常用凝胶：交联葡聚糖、聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖（胺凝胶，琼脂糖（sepharose 或或 Bio-Gel A）；）；凝胶网孔大小一定，只允许相

12、应大凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外，即分子则被排阻在外，即分级分离范围级分离范围或排阻极限或排阻极限;大分子从颗粒间隙流下来，洗脱液大分子从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小。小分子在颗粒网状结构洗体积小。小分子在颗粒网状结构洗脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积大；大；用洗脱体积同标准分子量的蛋白质用洗脱体积同标准分子量的蛋白质的比例关系测定蛋白质分子量；的比例关系测定蛋白质分子量；(二)凝胶过滤凝胶过滤层析、大小排阻层析或凝胶渗透层析凝胶过滤层析、大小排阻层析或凝胶渗透层析 Vt:柱床总体积，常称柱

13、床总体积，常称柱床体积；柱床体积；V0：为孔隙体积或：为孔隙体积或外水体积外水体积，测出不，测出不被凝胶滞留的蓝色葡聚糖被凝胶滞留的蓝色葡聚糖-2000的洗脱的洗脱体积即为体积即为V0;Vi：内水体积内水体积，凝胶珠内部的水相体积；，凝胶珠内部的水相体积；Vm：为凝胶基质体积；：为凝胶基质体积；Vt=V0+Vi+Vm Ve某一待分离物质组分的洗脱体积某一待分离物质组分的洗脱体积,自自加样品开始到该组分的洗脱峰加样品开始到该组分的洗脱峰(峰顶峰顶)出出现时所流出的体积；现时所流出的体积；各组分的流出顺序，可用分配系数各组分的流出顺序，可用分配系数Kd来量度：来量度：Kd=(VeVo)/Vi。几个

14、要说明的问题 V0 VtV0 VtA.Kd：组分分子大小的函数；：组分分子大小的函数；B.完全排阻的大分子：完全排阻的大分子：Ve=V0，Kd=0;C.完全进入凝胶珠的小分子：完全进入凝胶珠的小分子：Ve=V0+Vi，Kd=1;D.其他的：其他的：Kd在在0和和1之间之间;E.Kd大于大于1：凝胶对组分有吸附：凝胶对组分有吸附几个要说明的问题 V0 VtV0 VtA.Kd：组分分子大小的函数；：组分分子大小的函数；B.完全排阻的大分子：完全排阻的大分子：Ve=V0，Kd=0;C.完全进入凝胶珠的小分子：完全进入凝胶珠的小分子：Ve=V0+Vi，Kd=1;D.其他的：其他的：Kd在在0和和1之间

15、之间;E.Kd大于大于1：凝胶对组分有吸附：凝胶对组分有吸附测得几种标准蛋白质的洗脱测得几种标准蛋白质的洗脱体积体积 Ve 以相对分子质量对数以相对分子质量对数(logM)对对 Ve 作图，得标准作图，得标准曲线，再测出未知样品洗脱曲线，再测出未知样品洗脱体积体积Ve，从标准曲线上可，从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子查出样品蛋白质的相对分子质量质量.(三)盐溶和盐析A.A.盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶盐溶；B.B.盐析盐析:当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的

16、溶解度又随当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为现象称为盐析盐析;C.C.同一浓度盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可同一浓度盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。达到彼此分离的目的。D.D.盐溶原理盐溶原理:蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。E.E.盐析原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水盐析原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相

17、互聚积并从溶液中析出溶液中析出(四)有机溶剂分级分离法A.降低水溶液的介电常数，破坏大分子周围水膜，使溶质溶降低水溶液的介电常数，破坏大分子周围水膜，使溶质溶解度降低解度降低;B.利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，有机溶剂沉淀法。经常使用的有机使蛋白质分离的方法，有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮；溶剂是乙醇和丙酮；C.易使蛋白质和酶变性，操作必须在低温条件下进行易使蛋白质和酶变性，操作必须在低温条件下进行.电泳：在外电场的作用下电泳：在外电场的作用下,带电颗粒带电颗粒,例如带电的蛋白质分子例如带

18、电的蛋白质分子,将向将向着与其电荷符号相反的电极移动着与其电荷符号相反的电极移动,这种现象称为这种现象称为电泳电泳(electrophoresis)或离子泳或离子泳(ionophoresis)。(五)凝胶电泳和等电聚焦SampleWellDirection of migration带电颗粒在电场中泳动时带电颗粒在电场中泳动时,受到两种方向相反的作用力受到两种方向相反的作用力:q：颗粒所带电量；颗粒所带电量；E：电场强度：电场强度U/d；U：两电极间的电势差：两电极间的电势差(V)；d：两电极间距离：两电极间距离(cm)；f 摩擦系数；摩擦系数；v：泳动速度：泳动速度(cm/s)；当颗粒以恒稳速

19、度移动时当颗粒以恒稳速度移动时,则则FFf=0在一定介质中对某一蛋白质来说，在一定介质中对某一蛋白质来说，q/f 是一定值，因而是一定值，因而 v/E 也是也是定值，它被称为定值，它被称为电泳迁移率或泳动度电泳迁移率或泳动度:=v/EdUqqEF)(电场力fvFf)(摩擦力fqEv电泳原理：电泳原理：A stable pH gradient is established in the gel after application of an electric field.Protein solution is added and electric field is reapplied.After

20、 staining,proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values.等电聚焦等电聚焦(IEF)pH梯度制作：利用两性电解质梯度制作：利用两性电解质(商品名商品名:Ampholine)，多氨基多羧多氨基多羧酸系列两性化合物酸系列两性化合物同系物同系物的复杂混合物的复杂混合物，它们有相近但不同的，它们有相近但不同的pH和和pI值，在电场作用下，自然形成值，在电场作用下，自然形成pH梯度梯度.First dimensionIsoelectric focusingIsoelectri

21、c focusing gel is placed on SDSpolyacrylamide gel.Second dimensionSDS polyacrylamidegel electrophoresis双向电泳双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)利用蛋白质分子对其配体利用蛋白质分子对其配体(或称或称为配基为配基)分子特有的识别能力建分子特有的识别能力建立起来的纯化方法立起来的纯化方法.将特异配体共价地连接到像琼脂将特异配体共价地连接到像琼脂糖凝胶这类载体表面的官能团糖凝胶这类载体表面的官能团(如如-OH)上，配体和多糖载体之上，配体和多糖载体之间插人一

22、段长度适当的连接臂间插人一段长度适当的连接臂(如如-氨基己酸氨基己酸)，使配体与凝胶，使配体与凝胶之间保持足够的距离，不致因载之间保持足够的距离，不致因载体表面的位阻妨碍待分离的分子体表面的位阻妨碍待分离的分子与配体结合与配体结合.这类载体在其他性能方面允许蛋这类载体在其他性能方面允许蛋白质能自由通过白质能自由通过.(七)亲和层析(affinity chromatography)洗涤除去琼脂糖凝胶珠配体分子杂蛋白分子(不被吸附)连接臂被吸附的蛋白质分子亲和洗脱亲和层析的原理是离子交换层析、凝胶过滤、是离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析和分配层析等技术的吸附层析和分配层析等技术的新发展新发展.对柱

23、层析来说对柱层析来说,固相载体的颗固相载体的颗粒愈小、分辨率愈高粒愈小、分辨率愈高,但是洗但是洗脱液的流速也愈慢。采取高压脱液的流速也愈慢。采取高压和机械性能强、化学性能稳定、和机械性能强、化学性能稳定、颗粒度细小而均匀的载体和其颗粒度细小而均匀的载体和其他设备自动完成分离纯化他设备自动完成分离纯化.HPLCHPLC可用于蛋白质、氨基酸及可用于蛋白质、氨基酸及其他生物分子的分析和制备。其他生物分子的分析和制备。(八)高效液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)溶剂过滤器溶剂储存器泵检测仪记录仪收集器恒温装置层析柱进样室一、蛋白质的酸碱性

24、质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定教学内容教学内容五、蛋白质相对分子质量的测定(一一)凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量(二二)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量(三三)沉降速度法测定相对分子质量沉降速度法测定相对分子质量 蛋白质过凝胶柱速度直接取决于它的蛋白

25、质过凝胶柱速度直接取决于它的斯托克半径。如某种蛋白质与一理想斯托克半径。如某种蛋白质与一理想的非水化球体具相同过柱速度即相同的非水化球体具相同过柱速度即相同的洗脱体积，则这种蛋白质具与此球的洗脱体积，则这种蛋白质具与此球体相同的半径，称体相同的半径，称斯托克半径。斯托克半径。标准蛋白质标准蛋白质(已知已知Mr和斯托克半径和斯托克半径)和和待测蛋白质须有相同分子形状待测蛋白质须有相同分子形状(接近球接近球体体),否则不能得到比较准确的否则不能得到比较准确的Mr.一般用交联葡聚糖（一般用交联葡聚糖（Sephadex）,Sephadex G-75(分级分离的分级分离的Mr范围范围3 00080 00

26、0)或或G-100(M,范围范围4000150 000).(一)凝胶过滤法测定相对分子质量1966,Andrews提出个经验公式提出个经验公式:erbVaMlg（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量A.SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用破坏蛋白氢键和疏水相互作用,巯基乙醇能打开二硫巯基乙醇能打开二硫键键,SDS和巯基乙醇存在下和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解寡聚蛋白质解离成亚基离成亚基)处展开状态处展开状态.B.SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体.在在一定条件下一定条件下,SDS与大多数蛋白质的结合比

27、与大多数蛋白质的结合比:1.4g SDS/1 g蛋白质蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS.C.SDS 与蛋白质结合后与蛋白质结合后:第一第一,SDS 阴离子使多肽链覆盖上阴离子使多肽链覆盖上相同密度的负电荷相同密度的负电荷,远超过蛋白质原有电荷量远超过蛋白质原有电荷量,掩盖了不同掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别蛋白质间原有的电荷差别;第二第二,改变蛋白质的天然构象改变蛋白质的天然构象,使大多数蛋白质采取类似的形状使大多数蛋白质采取类似的形状.因此在因此在 SDS 存在下的电存在下的电泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的泳几乎是完全基于相对分子

28、质量分离蛋白质的.（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量SDS-PAGE，迁移率不受蛋，迁移率不受蛋白质原有的电荷、分子形白质原有的电荷、分子形状等因素影响状等因素影响,但凝胶具分但凝胶具分子筛效应子筛效应.因此，迁移率与因此，迁移率与相对分子质量相对分子质量(Mr)之关系之关系:rrbaMlg常数常数相对迁移率：相对迁移率：样品迁移距离样品迁移距离/前沿前沿(染料染料)（三）沉降速度法测定相对分子质量直接测定蛋白质直接测定蛋白质Mr的方法：渗透压法、光散射法、沉降速度法、的方法：渗透压法、光散射法、沉降速度法、沉降平衡法和黏度法等，沉降速度法是经典的常用方法沉降平衡法和黏度法等，沉

29、降速度法是经典的常用方法.A.超速离心机最大转速超速离心机最大转速:6000080 000r/min,相当于位于距转轴相当于位于距转轴中心中心10 cm处、单位质量处、单位质量(1g)分子所受到的离心力分子所受到的离心力(离心场强度离心场强度)为为400 000 g700 000 g.B.沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂密度且与溶剂密度和黏度有关和黏度有关.C.单位离心场强度的沉降速度称为单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数沉降系数,用用s(小写小写)表示表示:xdtdxs2/从轴心到沉降界面的径向距离从轴心到沉降界面的径向距离(cm)

30、时间时间离心角速度离心角速度(rad/s):转速转速(r/min)2/60（三）沉降速度法测定相对分子质量蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数：蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数：1 10-13200 10-13秒范围秒范围.把把l0-13s 作为一个单位作为一个单位,斯维得贝格单位斯维得贝格单位(Svedberg unit)或称或称沉降系数单位沉降系数单位,用用S(大写大写)表示表示.例如人血例如人血红蛋白红蛋白:4.46S,即即4.46 10-13s。蛋白质的沉降系数蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量与相对分子质量(Mr)的关系可用斯维的关系可用斯维得贝格方程表达得贝格方程表达:)

31、1(vDRTsMr摩尔气体常数摩尔气体常数(8.314JK-1mol-1);热力学温度热力学温度(K),旧称绝对温度旧称绝对温度蛋白质的扩散系数蛋白质的扩散系数(cm2/s),数值上等于当数值上等于当浓度梯度为浓度梯度为1个单位时在个单位时在1 s内通过内通过1 cm2面面积的蛋白质质量积的蛋白质质量溶剂的密度溶剂的密度(g/cm3)偏微比体积偏微比体积(cm3/g)又称偏微比容又称偏微比容,蛋白质蛋白质溶于水的偏微比容约溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g沉降系数沉降系数六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定常用电泳法常用电泳法(IEE、PAGE和和SDS-PAGE)、HPLC法、免疫学方法等法、

32、免疫学方法等.此外此外,N-末端分析末端分析也用于纯度鉴定也用于纯度鉴定(一)蛋白质含量测定 凯氏定氮法：已不多用凯氏定氮法：已不多用 Folin-酚试剂法酚试剂法(Lowry法法):基于基于Cu2+Cu+双缩脲法双缩脲法 紫外吸收法紫外吸收法:精确度不高精确度不高,操作简便操作简便,样品可回收样品可回收,适用于核酸测定适用于核酸测定 染料结合法染料结合法(Bradfold法法):考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250结合法结合法,灵敏度高灵敏度高(1g),BCA法法:新开发的新开发的,碱性条件碱性条件,4,4-二羧二羧-2,2-二醌二醌(CBA)与与Cu+形成紫色形成紫色复合物复合物,反应比反应比F

33、olin-酚试剂更强酚试剂更强 生物活性测定法生物活性测定法:利用酶或激素特有的活性测定利用酶或激素特有的活性测定 抗原抗原-抗体法抗体法:没特异生物学活性的蛋白没特异生物学活性的蛋白,注入动物体内产生抗体注入动物体内产生抗体,利用利用抗原抗原-抗体反应测定蛋白含量抗体反应测定蛋白含量 生物学活性测定和总蛋白量测定配合生物学活性测定和总蛋白量测定配合:鉴定纯化程度鉴定纯化程度(比活力比活力)(二)蛋白质纯度鉴定基本要求1.掌握蛋白质的酸碱性质。2.掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。3.掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方法和原理。4.掌握蛋白质分离纯化的一般原则。5.熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。6.掌握蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。作业题：第作业题：第1、2、3、8、9、10题题