原生质体杂交和体细胞杂交课件.ppt

1、第第9章章 原生质体培养和体原生质体培养和体细胞杂交细胞杂交 原生质体（Protoplast）含义：含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。生活力的裸露细胞。微微 丝丝叶绿体叶绿体线粒体线粒体质质 膜膜细胞核细胞核内质网内质网微微 管管细胞壁细胞壁高尔基体高尔基体液液 泡泡 细胞融合就是两个不同物种的活细胞紧密接触在一起，细胞融合就是两个不同物种的活细胞紧密接触在一起，使接触部位的细胞膜发生融化。这样，两个细胞的细胞质、使接触部位的细胞膜发生融化。这样，两个细胞的细胞质、细胞器互相交流，最后完全合并成一个细胞，通过细胞培细胞器互相交流，最后完全合并成一个

2、细胞，通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，即原来养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，即原来两个细胞所属的物体的杂种后代，这个杂种后代有可能兼两个细胞所属的物体的杂种后代，这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状有两个上代的一些优良性状。细胞融合细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交 用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。打破了不同种生物间杂种细胞培育成新的植物体的方法。打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交

3、的亲本组合范围。植物体细胞杂交过程示意图植物体细胞杂交过程示意图(1)(1)(2)(3)(4)(5)9.1 9.1 原生质体分离及纯化原生质体分离及纯化 一、原生质体分离原生质体分离双子叶外植体双子叶外植体胚性细胞胚性细胞 多数植物分离原生质体的经典材料多数植物分离原生质体的经典材料-叶肉叶肉细胞。细胞。（一）材料选择（一）材料选择 禾本科植物：禾本科植物：愈伤组织或悬浮细胞。愈伤组织或悬浮细胞。1 1、暗处理、暗处理2 2、预培养、预培养3 3、预萎焉、预萎焉4 4、预质壁分离、预质壁分离（二）（二）预处理预处理（三）（三）分离方法分离方法机械分离法机械分离法酶法分离法酶法分离法1 1、机械

4、分离法（、机械分离法（MachanicalMachanical isolation isolation）优点：优点：（1 1）能排除酶的有害影响能排除酶的有害影响；缺点：缺点：（1 1）原生质体的产量低；原生质体的产量低；（2 2）方法繁琐费力；）方法繁琐费力；（3 3）局限性大）局限性大（1 1）酶的种类）酶的种类l纤维素酶类（纤维素酶类（CellulaseCellulase）l果胶酶类（果胶酶类（PectolyasePectolyase）l半纤维素酶类（半纤维素酶类（HemicellulaseHemicellulase）l崩溃酶崩溃酶l蜗牛酶蜗牛酶2、酶法分离（酶法分离（Enzymatic

5、 isolation）（2 2）酶液的配制）酶液的配制渗透压稳定剂渗透压稳定剂及及pH酶的配比及浓酶的配比及浓度度（3）分离原生质体两步分离法两步分离法一步分离法一步分离法方法有二：方法有二：叶肉原生质体分离提纯叶肉原生质体分离提纯图示原生质体分离过程（以叶片为例）图示原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心过滤、离心加加果胶酶果胶酶和纤维素酶和纤维素酶叶片叶片愈伤组织愈伤组织叶肉原生质体叶肉原生质体二、原生质体纯化与活力测定（一）原生质体纯化（一）原生质体纯化方法三种方法三种离心沉淀法离心沉淀法漂浮法漂浮法界面法界面法1 1、离心沉淀法离心沉淀法 原理原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后

6、原生质：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。体沉于底部。步骤步骤：第一步原生质体溶液用第一步原生质体溶液用400400目网筛过滤。目网筛过滤。第二步离心（第二步离心（500-1000r/min500-1000r/min，离心，离心5-6min5-6min）。）。第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此如此2-32-3次。次。第四步用原生质体培养液洗第四步用原生质体培养液洗1 1次，收集原生质体。次，收集原生质体。2 2、漂浮法、漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体

7、漂浮在液体的表面。在液体的表面。步骤步骤：第一步：第一步：400400目网筛过滤。目网筛过滤。第二步：离心。第二步：离心。第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。2-32-3次。次。第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1 1次。次。3、界面法界面法25%蔗糖溶液蔗糖溶液13%甘露醇溶液甘露醇溶液原理：原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。另一种溶液小于原生质体的密度。纯化后的原生质体（二

8、）（二）原生质体活力测定原生质体活力测定1 1、形态识别：、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。2 2、染色识别、染色识别 1 1）0.1%0.1%酚番红或酚番红或EvansEvans蓝染色：有活力的不被染色，蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。死亡的被染上色。2 2）双醋酸盐荧光素）双醋酸盐荧光素(FDA)(FDA)染色法：在荧光显微镜下有染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。荧光的即为有活性的原生质体。9.2 原生质体培养原生质体培养 1、原生质体培养基、原生质

9、体培养基 无机盐：大量元素浓度；无机盐：大量元素浓度；NONO3 3和和NHNH4 4+的比例；的比例；CaCa2+2+浓度浓度 有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。酪蛋白。激素：常用的激素：激素：常用的激素：NAANAA、IAAIAA、BABA与与2,4-2,4-D D 渗透压：常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄渗透压：常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗 2、原生质体培养方法原生

10、质体培养方法液体浅层培养液体浅层培养 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。行培养。优点：优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转移培养物。移培养物。缺点：缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。的发育情况。液体固体双层培养液体固体双层培养 在培养皿的底部铺一层琼脂

11、糖固体培养基，再将原生质体悬在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。浮液滴于固体培养基表面。优点：优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：缺点：不易观察细胞的发育过程。不易观察细胞的发育过程。固体平板培养固体平板培养 即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约即琼脂糖包埋培养

12、。低融点的琼脂糖可在约3030融化与原生质融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。优点：优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。裂频率。缺点：缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生

13、质体不易混合均匀。易混合均匀。琼脂糖珠培养琼脂糖珠培养 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约5050ulul一一滴的量滴于直径滴的量滴于直径6 6cmcm的培养皿，待其固化后向其中添加的培养皿，待其固化后向其中添加3 3mlml液体液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营

14、养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。3、原生质体发育和植株再生原生质体发育和植株再生细胞壁再生细胞壁再生细胞分裂与生长细胞分裂与生长愈伤组织形成愈伤组织形成植株再生植株再生细胞壁的再生细胞壁的再生 原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。可形成完整的细胞壁。电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤维，然后转移到质膜表面质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤维，然后转移到质膜表

15、面进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层之间或在进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。的细胞壁。细胞分裂和生长细胞分裂和生长 一般原生质体培养一般原生质体培养2 27 7d d后开始第一次分裂，但开始第一次后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。质量、培养基的成分和培养条件而异。一般用幼苗的下胚轴、子叶、幼根、悬浮培养细胞、

16、未成一般用幼苗的下胚轴、子叶、幼根、悬浮培养细胞、未成熟种子子叶等为材料分离的原生质体，比用叶分离的原生质体熟种子子叶等为材料分离的原生质体，比用叶分离的原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。愈伤组织形成愈伤组织形成 通常原生质体培养通常原生质体培养2 2周后，形成多细胞的细胞团，周后，形成多细胞的细胞团，3 3周后形成周后形成肉眼可见的小细胞团，约肉眼可见的小细胞团，约6 6周后形成直径周后形成直径1 1mmmm的小愈伤组织。的小愈伤组织。原生质体培养原生质体培养7 71010d d后需及时添加新鲜培养基，否则形成的后需及时添加新鲜培养基，否

17、则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤组织长至约细胞团不继续生长。待小愈伤组织长至约1 1mmmm时应及时转移到固时应及时转移到固体培养基上使其进一步生长。体培养基上使其进一步生长。植株再生植株再生 原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗。成苗。但越来越多的试验证明，两步成苗法更适合大多数植物原但越来越多的试验证明，两步成苗法更适合大多数植物原生质体再生植株。即：首先将愈伤组织培养于含低浓度生长生质体再生植株。即：首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态，再将其转移到分化培养素培养基上，让其增殖和调整状态，再将

18、其转移到分化培养基上分化成苗。基上分化成苗。Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye.a Friable embryogenic calli,b suspension cell aggregates,c freshly isolated protoplasts from suspension culture,d protoplasts stained with FDA,e division of cell derived from protoplasts,f cell colonies derived from

19、 protoplast,g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose,h green shoot formation,i fertile green planta:first division,10 days after protoplast isolationb,c:2 and 3 wo microcolonies.d,e:4 and 6 wo microcallif:8 wo microcalli just before being transferred onto B5h mediumabcdefihgRecov

20、ery of plantlets through somatic embryogenesisg:Transfer of microcalli onto B5H medium and induction of somatic embryos.h:Transfer of globular embryos onto Boi2y medium for maturation of somatic embryos.i:Transfer of cotyledonary stage embryos onto MS medium for conversion of embryo into plantlets.9

21、.3 9.3 植物原生质体的融合植物原生质体的融合植物原生质体的融合技术植物原生质体的融合技术1 1、盐类融合法、盐类融合法1 1）硝酸盐类。）硝酸盐类。NaNONaNO3 3,KNO,KNO3 3,Ca(NO,Ca(NO3 3)2 2;2 2）氯化物类。）氯化物类。NaClNaCl，CaClCaCl2 2，BaClBaCl2 2等；等；3 3）葡聚糖硫酸盐类。葡聚糖硫酸钾，葡聚糖硫酸钠等。）葡聚糖硫酸盐类。葡聚糖硫酸钾，葡聚糖硫酸钠等。优点：对原生质体破坏小优点：对原生质体破坏小 缺点：异核体形成的频率不高。缺点：异核体形成的频率不高。2 2、高、高CaCa2 2、高、高pHpH融合法融合法

22、 当钙离子达到当钙离子达到0.05mol/L0.05mol/L时，时，pH9.510.5pH9.510.5时融合效果比时融合效果比较好较好 优点：融合效果好优点：融合效果好 缺点：高缺点：高pHpH对原生质体产生危害对原生质体产生危害3 3、聚乙二醇融合法、聚乙二醇融合法(PEG(PEG法）法）加拿大华人高国楠提出。加拿大华人高国楠提出。优点：融合效率高，可重复性强，毒性底，形成双核优点：融合效率高，可重复性强，毒性底，形成双核异核体比例高。异核体比例高。4 4、PEGPEG、高、高CaCa2 2、高、高pHpH相结合的融合法相结合的融合法 是目前认为最好的方法是目前认为最好的方法5 5、电融

23、合法、电融合法 电融合法是将一定密度的原生质体悬浮液至于一个融电融合法是将一定密度的原生质体悬浮液至于一个融合的小室中，小室两端装有电极。在不均匀的交变电合的小室中，小室两端装有电极。在不均匀的交变电场的作用下，原生质体彼此靠近，紧密接触，在两个场的作用下，原生质体彼此靠近，紧密接触，在两个电极间排列呈珠状。电脉冲可使质膜发生可逆性电击电极间排列呈珠状。电脉冲可使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。穿，从而导致融合。杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选 亲本细胞（亲本细胞（A A）和亲本细胞（）和亲本细胞（B B）进行植物原生质体）进行植物原生质体融合后，含有五种细胞，分别是融合后，含有五种细胞，分别

24、是A A，AAAA，ABAB，B B，BBBB。其中杂合细胞为其中杂合细胞为ABAB，但是比例很少，占，但是比例很少，占0.510%0.510%左右。左右。因此，必须要进行杂种细胞的筛选。因此，必须要进行杂种细胞的筛选。1 1 遗传互补法选择遗传互补法选择1 1、营养缺陷型互补、营养缺陷型互补硝酸还原酶缺失（硝酸还原酶缺失（NRNR-）筛选）筛选亲本亲本A A（NRNR脱辅基酶缺失，脱辅基酶缺失，niania型）型）亲本亲本B B（钼辅助因子缺失，（钼辅助因子缺失，cnxcnx型）型）不能在非还原氮下生存。不能在非还原氮下生存。杂合体杂合体ABAB因两种辅基都具有，因此能在非还原氮下因两种辅基

25、都具有，因此能在非还原氮下生存。而生存。而A A，B B，AAAA，BBBB均缺失一个辅助因子而不能生均缺失一个辅助因子而不能生存。存。2 2、抗性互补法、抗性互补法亲本亲本A A抗抗5-5-甲基色氨酸甲基色氨酸亲本亲本B B抗抗S-S-氨乙基半胱氨酸氨乙基半胱氨酸杂合体抗杂合体抗5-5-甲基色氨酸和甲基色氨酸和S-S-氨乙基半胱氨酸（双抗）。氨乙基半胱氨酸（双抗）。可见标记法可见标记法1 1、凹穴皿分离法、凹穴皿分离法2 2、微吸管分离法、微吸管分离法4 4、体细胞杂种的鉴定体细胞杂种的鉴定 1 1、杂种植物的形态学鉴定、杂种植物的形态学鉴定 2 2、杂种植物的细胞学鉴定、杂种植物的细胞学鉴

26、定 3 3、杂种植物的生化分析鉴定、杂种植物的生化分析鉴定葡萄与柴胡科间体细胞杂交再生杂种植株形成葡萄与柴胡科间体细胞杂交再生杂种植株形成实验步骤：实验步骤：(1)(1)葡萄与柴胡原生质体融合葡萄与柴胡原生质体融合培养用葡萄品种培养用葡萄品种“胜利胜利”的花药接种在培养基上，诱导愈伤组织，的花药接种在培养基上，诱导愈伤组织，继代后新长出的小颗粒状愈伤组织悬浮细胞系，用作融合受体。继代后新长出的小颗粒状愈伤组织悬浮细胞系，用作融合受体。狭叶柴胡幼茎茎节诱导并筛选出淡黄色粉粒状愈伤组织，继代培养狭叶柴胡幼茎茎节诱导并筛选出淡黄色粉粒状愈伤组织，继代培养建立悬浮细胞系，用作融合供体。建立悬浮细胞系，用作融合供体。受体与供体以葡萄受体与供体以葡萄狭叶柴胡狭叶柴胡=11=11的比例混合均匀，用的比例混合均匀，用PEGPEG法诱导法诱导融合。融合。(2)(2)杂种鉴定杂种鉴定。染色体组型分析同工酶鉴定(3)(3)形态比较形态比较