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1、第五章第五章 分子生物学研究方法（上）分子生物学研究方法（上）DNA、RNA、蛋白质操作技术、蛋白质操作技术从从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是现代分子生物学研究方法，发展，主要原因之一是现代分子生物学研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是扩增等，是

2、分子生物学研究的核心技术。分子生物学研究的核心技术。5.1 重组重组DNA技术技术回顾回顾 5.2 DNA基本操作技术基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用的理论与应用 5.5 基因克隆技术基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术蛋白质组与蛋白质组学技术本章主要内容：本章主要内容：5.1 重组重组DNA技术技术回顾回顾5.1.1 5.1.1 重组重组DNADNA技术诞生的理论基础技术诞生的理论基础5.1.2 5.1.2 关键性实验技术问世为重组关键性实验技术问世为重组DNADNA技术奠基技术奠基 5.1.3 5.1.3 重组重组DNADNA技术的

3、概念技术的概念5.1.4 5.1.4 重组重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤 5.1.5 5.1.5 重组重组DNADNA技术的意义技术的意义 5.1.6 5.1.6 重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶5.1.7 5.1.7 目的基因的来源目的基因的来源5.1.8 5.1.8 重组实验中的基因载体重组实验中的基因载体5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾 4040年代明确了遗传的物质基础是年代明确了遗传的物质基础是DNA DNA 5050年代揭示了年代揭示了DNA DNA 分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因

4、的自我复制和遗传信息保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题传递问题 。5050年代末和年代末和6060年代提出了年代提出了“中心法则中心法则”和操纵和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。了遗传信息的流向和表达问题。5.1.1 5.1.1 重组重组DNADNA技术诞生的理论基础技术诞生的理论基础5.1.2 5.1.2 关键性实验技术问世为重组关键性实验技术问世为重组DNADNA技术奠基技术奠基 1 1、DNADNA分子的切割与连接技术分子的切割与连接技术 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(1972)(1972)

5、和连接酶和连接酶(1967)(1967)的陆续发现，才的陆续发现，才使分子生物学家有了进行使分子生物学家有了进行DNADNA操作的基本工具。操作的基本工具。2 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 19701970年年M.MandelM.Mandel和和A.HigeA.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收钙适当处理之后，便能吸收噬菌体的噬菌体的DNADNA。19721972年美国年美国斯坦福大学斯坦福大学S.CohenS.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒也

6、能摄取质粒DNADNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNADNA技术的创立具有特别重要的意义。技术的创立具有特别重要的意义。3 3、SouthernSouthern杂交、杂交、DNADNA序列分析和聚合酶链反应序列分析和聚合酶链反应 5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾Southern印迹结果印迹结果 重组重组DNADNA技术技术(recombinant DNA technique):(recombinant DNA technique):是是按照人们意愿，在体外对按照人们意愿，在体外对DNADNA分子进行重组分子进行重组,再将再将重组分子导入

7、受体细胞，使其在细胞中扩增和繁重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该殖，以获得该DNADNA的大量拷贝。的大量拷贝。基因克隆基因克隆(gene cloning)(gene cloning)分子克隆分子克隆(molecular cloning)(molecular cloning)5.1.3 5.1.3 重组重组DNADNA技术的概念技术的概念5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾克隆克隆来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合5.1.4 5.1.4 重组重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤 1 1、四大要素、四大要素 外源基因（

8、目的基因）外源基因（目的基因）载体载体 工具酶工具酶 受体细胞受体细胞 5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾2 2、重组、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤 目的基因的获得与载体的制备目的基因的获得与载体的制备 目的基因与载体目的基因与载体DNADNA的连接的连接 重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 重组体的筛选与重组重组体的筛选与重组DNADNA的鉴定的鉴定 克隆基因的表达及表达产物的检测与分克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化离纯化 5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾重组重组DNADNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载

9、体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNADNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为：分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细

10、胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 5.1.5 5.1.5 重组重组DNADNA技术的意义技术的意义 重组重组DNADNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 重组重组DNADNA技术缩短了进化时间技术缩短了进化时间 重组重组DNADNA技术使人能对生物进行定向改造技术使人能对生物进行定向改造 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。义。5.1

11、5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾酶类酶类限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶多核苷酸激酶多核苷酸激酶末端转移酶末端转移酶DNADNA外切酶外切酶噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶功能功能识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNA通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接成一个片段连接成一个DNADNA分子分子按按5 5到到3 3方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双链中的双链中的缺口缺口按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互

12、补原则合分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成成DNADNA链链把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5 5-OH-OH末端末端在双链核酸的在双链核酸的3 3末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸从从DNADNA链的链的3 3末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸从从DNADNA链的链的5 5末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸切除位于切除位于DNADNA链链5 5或或3 3末端的磷酸基团末端的磷酸基团5.1.6 5.1.6 重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾限制性核酸内切酶限制性核酸内

13、切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)(restriction endonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶.1972年发现第一个内切核酸酶EcoR。分类分类:、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）5.15.1、重组重组DNADNA技术回顾技术回顾第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株

14、；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGG

15、HindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾 DNADNA连接酶连接酶:通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片片断连接成一个整体断连接成一个整体DNADNA分子。分子。19671967年相继发现。年相继发现。T T4 4DNADNA连接酶连接酶 EcoR I EcoR I 连接酶连接酶 T T7 7DNADNA连接酶连接酶5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序

16、列氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾5.1.7 目的基因的来源目的基因的来源化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组

17、基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因

18、文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T5.1.8 5.1.8 重组实验中的基因载体重组实验中的基因载体定义：定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些或表达有意义的蛋白质所采用的一些D

19、NADNA分分子。子。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列被扩增而特意设序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列可转录翻译成多序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。肽链而特意设计的载体称为表达载体。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾载体的选择标准载体的选择标准 能自主复

20、制能自主复制；具有两个以上的具有两个以上的遗传标记遗传标记物，便于重组体的筛选物，便于重组体的筛选和鉴定；和鉴定；有克隆位点有克隆位点（外源（外源DNADNA插入点），常具有多个单一插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾 噬菌体载体：噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5端突出粘性末端 噬菌体噬菌体 黏粒、黏粒、YACYAC、BAC BAC：高容量载体高容量载体5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾克

21、隆载体所容纳的外原克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小片段的大小 质粒：质粒：10kb 噬菌体：噬菌体：23kb 黏粒：黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程5.1 5.1 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾5.2 DNA基本操作技术基本操作技术5.2.1 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖5.2.3 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术5.2.4 实时定量实时定量PCR技术

22、技术5.2.5 基因组基因组DNA文库构建文库构建 在生理条件下，核酸分子之戊糖在生理条件下，核酸分子之戊糖-磷酸骨架中的磷酸基磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，团，呈离子化状态，DNA和和RNA多核苷酸链称为多聚阴多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于戊糖。由于戊糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，在一定的电

23、场强度下，DNADNA分子的迁移速度，取分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离凝胶电泳技术分离DNADNA片段的基本原理片段的基本原理。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术5.2.1 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术5.2 DNA基本操作技术基本操作技术琼脂糖凝胶电泳：分辨力琼脂糖凝胶电泳：分辨力0.250kb（常用）（常用）聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨力聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨力11000bp核酸分析核酸分析凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小；凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小；凝胶浓度越大，空隙越小，其分辨能力越

24、强；凝胶浓度越大，空隙越小，其分辨能力越强；反之，凝胶浓度越低，空隙越大，分辨能力越小。反之，凝胶浓度越低，空隙越大，分辨能力越小。2022-8-1736n 在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（EtBr）染）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有带中仅含有0.05g的微量的微量DNA，也可以被清晰地检测出，也可以被清晰地检测出来。来。n 溴化乙锭能插入到溴化乙锭能插入到DNA或或RNA分子的相分子的

25、相邻碱基之间，并在邻碱基之间，并在300nm的紫外线照射下发的紫外线照射下发出荧光。出荧光。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术n 荧光染料：溴化乙锭（荧光染料：溴化乙锭（EtBrEtBr）溴化乙锭染溴化乙锭染料的化学结构及料的化学结构及其对其对DNA分子的分子的插入作用。由于插入作用。由于插入了溴化乙锭插入了溴化乙锭分子，在紫外光分子，在紫外光照射下，琼脂糖照射下，琼脂糖凝胶电泳中凝胶电泳中DNA的条带便呈现出的条带便呈现出橘黄色荧光，易橘黄色荧光，易于鉴定。于鉴定。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术2022-8-1740 普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分

26、离大于50kb的的DNA分子，而要进行超大分子研究，要分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。用到脉冲电场凝胶电泳。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术2022-8-1741 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。传改变的生命过程。提供转化提供转化DNA的菌株叫作供体菌株；的菌株叫作供体菌株；接受转化接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。的细菌菌株则被称为受体菌株。5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖5

27、.2 DNA基本操作技术基本操作技术5.2 DNA基本操作技术基本操作技术转化（转化（transformationtransformation）：P163P163感受态细胞（感受态细胞（Competent cells）：受体细胞经过一些特殊方法（如：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称这种状态下的细胞称将异源将异源DNADNA分子引入一细胞株系，使受体细胞分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状获得新的

28、遗传性状转导？转导？转染？转染？感染？感染？常用的转化方法：常用的转化方法：化学转化（化学转化（CaCl2）法）法 电击法电击法 重组重组DNA分子的体外包装法分子的体外包装法5.2 DNA基本操作技术基本操作技术n 化学转化原理：化学转化原理：将快速生长中的大肠杆菌置于将快速生长中的大肠杆菌置于0冷冻处理时，冷冻处理时，处于处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形，低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形，DNA可吸附于其表面。可吸附于其表面。在在42下做下做短暂的热短暂的热刺激刺激下，外源下，外源DNA即被细即被细胞吸收。胞吸收。将转化后的细胞在选择培养基上培养，筛选出将转化后的细胞在

29、选择培养基上培养，筛选出带有外源带有外源DNA分子的阳性克隆。分子的阳性克隆。阳性克隆阳性克隆在全培养基中生长一段时间使转化基在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达因实现表达。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术n CaCl 2 法是制备大肠杆菌感受态细胞最常用的方法。法是制备大肠杆菌感受态细胞最常用的方法。n 电击转化：一种高效方法。电击转化：一种高效方法。使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。菌液：生长对数期菌液：生长对数期场强场强(最大转化效率最大转化效率

30、)：12.5-15kV/cm 温度：温度：0-4 5.2 DNA基本操作技术基本操作技术P1655.2 DNA基本操作技术基本操作技术重组重组DNA分子分子的体外包装法的体外包装法5.2 DNA基本操作技术基本操作技术DNA克隆的筛选：克隆的筛选：抗生素抗性基因。抗生素抗性基因。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等四环素、链霉素等 -互补蓝白斑筛选互补蓝白斑筛选 营养条件（自养、异养）营养条件（自养、异养）5.2 DNA基本操作技术基本操作技术 Antibiotic resistance genes5.2 DNA基本操作技

31、术基本操作技术 direct selectionThe procedure to form recombinant DNA -互补筛选互补筛选5.2 DNA基本操作技术基本操作技术n 质粒：携带质粒：携带-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控）的调控序列和氨基端（序列和氨基端（N端）端）146个氨基酸编码序列。个氨基酸编码序列。n 大肠杆菌：携带大肠杆菌：携带-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZ）羧基端）羧基端（C端）部分编码序列。端）部分编码序列。只有只有LacZ的的N端和端和C端全部表达，酶才有活性。端全部表达，酶才有活性。n IPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑的培养基上筛

32、选蓝白斑蓝白斑筛选蓝白斑筛选 Lac Z ,IPTG X-gal X +gal （白色）（白色）（蓝色）（蓝色）Lac Z（失活）（失活）,IPTG X-gal X-gal （白色）（白色）（白色）（白色）5.2 DNA基本操作技术基本操作技术 互互补补的的检检测测蓝白斑蓝白斑5.2 DNA基本操作技术基本操作技术转化率的计算：转化率的计算：转化体总数菌落数转化体总数菌落数（转化反应原液总体积（转化反应原液总体积/涂涂板菌液体积）板菌液体积）插入频率白色菌落数插入频率白色菌落数/蓝色菌落数蓝色菌落数+白色菌落数白色菌落数 转化频率转化体总数转化频率转化体总数/加入质粒加入质粒DNA的量（计算的

33、量（计算出每微克的转化菌落数）出每微克的转化菌落数）5.2 DNA基本操作技术基本操作技术5.2.3 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 1985年，年，K.Mullis等研究成功的一种在体外等研究成功的一种在体外快速扩增特定基因快速扩增特定基因DNA序列的方法序列的方法 原理：类似于天然的原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩复制过程。将待扩增的增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引片段和两侧互补的两段寡核苷酸引物，经过变性，退火和延伸若干个循环后，物，经过变性，退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达扩增倍数可达2n 倍倍5.2 DNA基本操作技术基本操作技术反应体系

34、反应体系 模板模板DNA：待扩增的目的片段 特异性引物：特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序列互补的寡核苷酸片段，15-30bp DNA聚合酶聚合酶 dNTP 含有含有Mg2+的缓冲液的缓冲液5.2 DNA基本操作技术基本操作技术PCRPCR的基本反应步骤：的基本反应步骤：1.1.变性变性：9595，模板，模板DNADNA变性为单链；变性为单链；2.2.退火退火：5050左右，使引物与模板左右，使引物与模板DNADNA退火结合；退火结合；3.3.延伸延伸：7272，DNADNA聚合酶以聚合酶以dNTPdNTP为底物催化为底物催化 DNADNA的合成反应。的合成反应。上述三个步骤为一个

35、循环，经上述三个步骤为一个循环，经25-3025-30次循次循 环后，可将模板环后，可将模板DNADNA扩增达百万倍。扩增达百万倍。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCRPCR基本反应步骤基本反应步骤5.2 DNA基本操作技术基本操作技术Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。5.2 DNA基本操作技术基本操

36、作技术PCR技术在基因克隆方面的应用技术在基因克隆方面的应用 （1）目的基因的直接克隆，）目的基因的直接克隆，（2）通过）通过RT-PCR进行进行cDNA的克隆；的克隆；（3）制备）制备DNA探针，进行分子检测等。探针，进行分子检测等。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术 PCR反应中，当引物模板与反应中，当引物模板与DNA聚合酶达到一定比值聚合酶达到一定比值时，时，DNA聚合酶催化的反应趋于饱和，出现聚合酶催化的反应趋于饱和，出现“平台效平台效应应”，即，即PCR反应产物不再增加。反应产物不再增加。定量定量PCRPCR与定性与定性PCRPCR测定测定 指数扩增期指数扩增期扩增的平台期扩增的

37、平台期5.2 DNA基本操作技术基本操作技术5.2.4 实时定量实时定量PCR技术技术实时实时PCR(real-time PCR)技术通过技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量定量PCR。2020世纪世纪9090年代末期出现。年代末期出现。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR PCR扩增反应中，引入一种荧光化学物质，对每一个循环产物荧光信号的实时检测 可以得到荧光扩增曲线 实现对起始模板定量和定性分析5.2 DNA基本操作技术基本操作技术两种定量化学两种定量化学5.2 DNA基本操作技

38、术基本操作技术荧光染料染色荧光染料染色 SYBR Green I 是一种是一种DNA小沟结合染料小沟结合染料与与DNA双链结合时发光双链结合时发光游离时不发光游离时不发光5.2 DNA基本操作技术基本操作技术 PCR过程中荧光染料的掺入：信号强度与双链过程中荧光染料的掺入：信号强度与双链DNA分子数正比。激发光波长分子数正比。激发光波长520nm。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术染料的特点染料的特点5.2 DNA基本操作技术基本操作技术 Taqman探针探针一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列扩增有关。探针5端连接荧光(报告)基团，3端连接淬灭基团。PCR延伸反应时，利用DNA聚合酶的5

39、 3外切酶活性，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光信号。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术5端连接荧光基团端连接荧光基团中段特异碱基序列（中段特异碱基序列（50-150bp）3端连接淬灭基团端连接淬灭基团信号强度与结合探针的信号强度与结合探针的DNADNA分子数成正比分子数成正比5.2 DNA基本操作技术基本操作技术n 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术原理技术原理n 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术原理技术原理QR3355上游引物上游引物下游引下游引物物荧光标记引物荧光标记引物RQ 33555.2 DNA基本操作技术基本操作技术 分子信标分子信标 TaqManTaqMan探针的衍生物探

40、针的衍生物 发夹型杂交探针发夹型杂交探针形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针发夹结构的两端分别连接荧光基团和淬灭基团。发夹结构的两端分别连接荧光基团和淬灭基团。利用分子构象的改变使得荧光基团和淬灭基团分开利用分子构象的改变使得荧光基团和淬灭基团分开。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术探针的特点探针的特点5.2 DNA基本操作技术基本操作技术方法方法优点优点缺点缺点适用范围适用范围SYBR SYBR Green I Green I 方法方法适用性广适用性广灵敏灵敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出现非特异性易出现非特异性带带不能进行多重定不能进行多重定量量适

41、合科研中对各种目适合科研中对各种目的基因定量分析，基的基因定量分析，基因表达量的研究，转因表达量的研究，转基因重组动植物的研基因重组动植物的研究究TaqMan TaqMan 方法方法特异性高特异性高重复性好重复性好多重定量多重定量价格高价格高只适合特定目标只适合特定目标病原体检测，疾病耐病原体检测，疾病耐药基因研究药基因研究,药物疗药物疗效考核效考核遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断不同实时定量方法的比较不同实时定量方法的比较5.2 DNA基本操作技术基本操作技术 基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)n 基因文库基因文库(g

42、ene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列的克隆群体。序列的克隆群体。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术5.2.5 基因组基因组DNA文库构建文库构建基因组基因组DNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编的信息（包括所有的编码区和非编码区）以码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。体、粘粒和酵母人工染色体等。5.2 DNA基本操作技术基本操作技术n基因组文

43、库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选体外包装体外包装噬菌体噬菌体5.3 RNA基本操作技术基本操作技术5.3.1 总总RNA的提取的提取5.3.2 mRNA的纯化的纯化5.3.3 cDNA的合成的合成5.3.4 cDNA文库的构建文库的构建5.3.5 基因文库的筛选基因文库的筛选5.3 RNA基本操作技术基本操作技术5.3.1 总总RNA的提取的提取 RNA易遭降解，实验要求较严格。总易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多提取的方法有多种，主要有种，主要有LiCl法、法、CTAB法、异硫氰酸胍法（法、异硫氰酸胍法（TriZol）。）。异硫氰酸胍法（异硫氰酸胍法（T

44、riZol）原理：）原理：TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白与蛋白质分离，并将质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋与仍留在有机相中的蛋白质和白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为分离开。水相层（无色）主要为RNA，

45、有机层，有机层（黄色）主要为（黄色）主要为DNA和蛋白质。和蛋白质。收集含有收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA。DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50 g/ml 双链双链DNA40g/ml RNA33g/ml 单链单链DNA 判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8-2.0u OD260的应用的应用5.3.2 mRNA的纯化的纯化5.3 RNA基本操作技术基本操作技术 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（的分离方法较多

46、，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。法最为有效，已成为常规方法。利用利用mRNA的的Poly A结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物，与引物，与Poly A杂交，形成生物素化寡聚杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂的杂交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用，形成抗交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用，形成抗生物素生物素-顺磁颗粒（顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体，形成生物素化）结合杂交体，形成生物素化寡聚寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条

47、吸附复合物中的磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高严紧度颗粒，最后利用高严紧度盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT引物与引物与mRNA分离，从而纯化得到分离，从而纯化得到mRNA。2022-8-1785PolyATtract mRNA的分的分离纯化过程离纯化过程简图简图5.3 RNA基本操作技术基本操作技术5.3.3 cDNA的合成的合成5.3 RNA基本操作技术基本操作技术 cDNA的合成包括第一链和第二链的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。的合成。第一链第一链cDNA的合成是以的合成是以mRNA为模板，反转录

48、为为模板，反转录为cDNA，有反转录酶催化，该酶合成有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引时需要引物引导，常用引物是物是oligo dT。第二链合成是以第一链为模板，由第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。聚合酶催化。cDNA文库是包含某一组织细胞在一文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部定条件下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录经逆转录而合成的而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。基因表达信息。5.3 RNA基本操作技术基本操作技术5.3.4 cDNA文库的构建文

49、库的构建 cDNA文库文库(complementary DNA library)以以组织细胞中的组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成为模板，反转录合成双链双链cDNA，各，各cDNA分子分别插入载体形分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的些在重组体内的cDNA的集合即的集合即cDNA文库。文库。5.3 RNA基本操作技术基本操作技术l cDNA文库构建基本程序：文库构建基本程序：构建步骤：构建步骤：1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物素 2、反转录生成cDNA:反转录酶，olig(dt),R6 3、与噬菌体载体分子连接 4

50、、噬菌体的包装5.3 RNA基本操作技术基本操作技术5.3 RNA基本操作技术基本操作技术mRNA逆转录酶cDNA复制双双链链c cD DN NA A载体重重组组D DN NA A分分子子受体菌含重组分子的转化菌5.3 RNA基本操作技术基本操作技术2022-8-1792 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有：筛选方法有很多种，常用的有：核酸杂交法：广泛的适用性和快速性。核酸杂交法：广泛的适用性和快速性。PCR筛选法：前提是获得基