精编第六章体外标记免疫分析课件.ppt

1、核医学核医学第六章第六章 体外标记免疫分析体外标记免疫分析体外标记在核医学中的地位 体内诊断：体内诊断：脏器显像脏器显像 功能测定功能测定 诊断诊断 体外诊断：体外诊断：放射分析放射分析 临床核医学临床核医学 治疗：治疗：131131I I治疗甲亢治疗甲亢核医学核医学 实验核医学：实验核医学：利用核技术探索生命现象的本质和物利用核技术探索生命现象的本质和物 质变化规律质变化规律体外标记免疫分析体外标记免疫分析是一门综合性学科，也是一门边缘学科。是集基础医学、实验医学及临床应用于一体的学科。在当前的各种免疫诊断技术中，标记免疫分析是最活跃、发展最快的一个领域。体外标记免疫分析概念：概念：是利用放

2、射分析方法或其派生的相关非放射分析技术测定生物样品中微量生物活性物质含量的一类分析方法。体外标记免疫分析特点：特点：利用抗原抗体结合反应的特异性，加上各种标记物（标记抗原或抗体）的可测量性来达到方便敏感地检测各种体内微量生物活性物质，包括内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等。体外标记免疫分析鼻祖:(Yalow,July 19,1921(Yalow,July 19,1921)美国科学家美国科学家YalowYalow和和BersonBerson。于于19561956年创建的年创建的放射免疫分析放射免疫分析(RIA)(RIA)，测定人血浆胰岛

3、素，测定人血浆胰岛素获得成功。获得成功。树立了超微量物质体外标记免疫分析的里程碑。树立了超微量物质体外标记免疫分析的里程碑。19681968年，年，MilesMiles和和HalesHales建立了建立了免疫放射分析免疫放射分析(IRMA)(IRMA)。体外标记免疫分析获奖获奖:在在19771977年年YalowYalow和和BersonBerson因创建了放射免疫因创建了放射免疫分析，使微量物质的测定成为可能，而荣获诺贝分析，使微量物质的测定成为可能，而荣获诺贝尔生物医学奖尔生物医学奖 。体外标记免疫分析贡献贡献:随着基础医学和相关技术的发展，在RIA标记抗原竞争性抑制结合、IRMA标记抗体

4、非竞争性结合的理论基础上，相继派生出许多其它的标记免疫分析方法，如酶标记免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析等多种形式、多种反应模式的综合性标记免疫分析体系，并广泛应用于基础医学、临床医学、教学及科研诸多领域，有力地推动了医学科学的发展。体外标记免疫分析发展发展:电化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析化学发光标记免疫分析 时间分辨荧光免疫分析 酶标记免疫分析 放射受体分析放射受体分析 免疫放射分析免疫放射分析 放射免疫分析放射免疫分析体外标记免疫分析竞争放射结合分析：竞争放射结合分析：标记抗原，抗体限量标记抗原，抗体限量非竞争放射结合分析：非竞争放射结合分析：标记

5、抗体，抗体过量标记抗体，抗体过量分分 类类第一节体外标记免疫分析的基本原理第一节体外标记免疫分析的基本原理体外标记免疫分析基本原理:非竞争性非竞争性(标记抗体标记抗体)IRMA体体外外标标记记免免疫疫分分析析竞争性竞争性(标记抗原标记抗原)RIA放射免疫分析（RIA）原理v放射免疫技术是标记抗原与未标抗原竞争有限量放射免疫技术是标记抗原与未标抗原竞争有限量的抗体，然后通过测定标记抗原抗体复合物中放的抗体，然后通过测定标记抗原抗体复合物中放射性强度的改变，测定出未标记抗原量。射性强度的改变，测定出未标记抗原量。放射免疫分析（RIA）原理 AgAg 待测抗原待测抗原 +*Ag+Ab Ag+Ab *

6、AgAb+AgAb+*Ag Ag(标记抗原标记抗原)()(特异性抗体特异性抗体)()(标记抗原抗体复合物标记抗原抗体复合物)()(游离的标记抗原游离的标记抗原)AgAb +Ag AgAb +Ag 抗原抗体复合物抗原抗体复合物放射免疫分析（放射免疫分析（RIA）原理）原理标记抗原(*Ag)和非标记原(Ag)与限量抗体(Ab)竞争结合。*Ag和Ag具有相同的与 Ab结合的能力RIA(RIA(竞争结合反应竞争结合反应)原理示意图原理示意图AgAg*AbCFAg*BFB/F.*Ag:定量、足量定量、足量.Ab:限量、特异限量、特异.*Ag和和Ag具有相同的免疫活性具有相同的免疫活性.Ag+*AgAb的

7、有效结合位点的有效结合位点.*Ag和和Ag通过竞争的方式与通过竞争的方式与Ab结合，随着结合，随着Ag增加，增加，*Ag与与Ab结合结合形成的形成的*AgAb复合物的量减少复合物的量减少放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）实验操作步骤：实验操作步骤：加样（加样（AgAg，*AgAg，Ab)Ab)混匀，温育（反应达到平混匀，温育（反应达到平衡）衡）分离分离测量测量数据处理，质量控制数据处理，质量控制测量测量复合物计数示意图：测量复合物计数示意图：光子光子(射线能射线能)与闪烁体的作用与闪烁体的作用 闪烁体闪烁体(光脉冲、光能光脉冲、光能)光电倍增管光电倍增管(电能电能)前置放大器前置放大器

8、(电脉冲电脉冲)电子探测仪电子探测仪 （计数单位是探测器输出的电脉冲数，（计数单位是探测器输出的电脉冲数，CPMCPM或或CPSCPS）RIA(RIA(竞争性结合竞争性结合)标准品剂量反应曲线标准品剂量反应曲线依所测得的复合物的放射性计数依所测得的复合物的放射性计数(CPM)，对比标准品剂量反应曲线，求知待测品的含量，对比标准品剂量反应曲线，求知待测品的含量免疫放射分析(IRMA)原理单位点：单位点：Ag +Ag +*Ab Ab (Ag-(Ag-*Ab)+Ab)+*AbAb 抗原（待测）抗原（待测）标记抗体标记抗体 抗原标记抗体复合物抗原标记抗体复合物双位点：双位点：Ad-Ag +Ad-Ag

9、+*Ab Ab Ad-Ag-Ad-Ag-*AbAb 固体抗体固体抗体-抗原（待测）抗原（待测）标记抗体标记抗体 固体抗体固体抗体-抗原抗原-标记抗体复合物标记抗体复合物IRMA(非竟争结合)反应原理IRMA(非竟争结合)剂量反应曲线RIA RIA IRMA IRMA 的区别的区别方法方法RIARIAIRMAIRMA1.1.标记标记*AgAg*AbAb2.2.免疫反应式免疫反应式Ag+Ag+*Ag+Ab Ag+Ab *Ag-Ab+AgAg-Ab+AgAg+Ag+*Ab Ab A Ag-g-*Ab+Ab+*AbAb3.Ab3.Ab限量限量过量过量4.4.竞争竞争竞争竞争非竞争非竞争5.5.测量复合

10、物测量复合物*Ag-AbAg-AbAg-Ag-*AbAb6.6.测量物计数值与标本含量测量物计数值与标本含量呈反比呈反比呈正比呈正比7.7.标准曲线形态标准曲线形态8.8.灵敏度灵敏度较低较低高高9.9.测量范围测量范围较窄较窄较宽较宽第二节 体外标记免疫分析的基本试剂和基本技术基本试剂和基本技术基本试剂和基本技术.标准品、质控品标准品、质控品.特异性抗体特异性抗体.示踪剂示踪剂(标记品标记品).分离技术分离技术 .标准品标准品 (1)(1)化学结构化学结构:应与待测物具有相同的化学结构应与待测物具有相同的化学结构 (2)(2)化学纯度：高度纯化化学纯度：高度纯化 (3)(3)化学度量：化学度

11、量：准确准确 (4)(4)稳定性：不易变质、不易降解稳定性：不易变质、不易降解.特异性抗体特异性抗体 (1)(1)亲和力大亲和力大 (2)(2)高滴度高滴度 (3)(3)特异性强特异性强 (4)(4)可长期保存可长期保存.示踪剂（标记品）示踪剂（标记品）（1 1）高比活度）高比活度（2 2）生物活性与免疫活性与标记前一致）生物活性与免疫活性与标记前一致（3 3）化学纯度）化学纯度95%95%（4 4）稳定性好：标记品不易脱落）稳定性好：标记品不易脱落.分离技术分离技术-要求要求(1)(1)结合部分与游离部分尽可能完全分开结合部分与游离部分尽可能完全分开(2)(2)非特异性结合率（非特异性结合率

12、（NSB%NSB%）低，小于）低，小于5%5%(3)(3)分离的成分便于测量分离的成分便于测量(4)(4)分离效果不受外界环境影响分离效果不受外界环境影响(5)(5)分离试剂操作简便、价廉易得分离试剂操作简便、价廉易得微孔滤膜法微孔滤膜法盐析法盐析法活性炭吸附法活性炭吸附法磁化颗粒法磁化颗粒法双抗体法双抗体法固相分离法固相分离法分离方法分离方法 第三节第三节 体外标记免疫分析的类型体外标记免疫分析的类型体外标记免疫分析的类型体外标记免疫分析体外标记免疫分析放射性核素标记免疫分析(RIA、IRMA)酶标记免疫分析发光标记免疫分析(化学发光标记免疫分析化学发光酶免疫分析电化学发光免疫分析)时间分辩

13、荧光免疫分析放射性核素标记免疫分析放射性核素标记免疫分析概念：概念：一种将放射性核素测量的高灵敏性、高精确一种将放射性核素测量的高灵敏性、高精确性和抗原抗体反应的高特异性相结合的体外测定性和抗原抗体反应的高特异性相结合的体外测定超微量（超微量（1010-9-91010-15-15g g）物质的新技术。）物质的新技术。放射性核素标记免疫分析分类:竞争性竞争性(标记抗原标记抗原,抗体限量抗体限量)RIA非竞争性非竞争性(标记抗体标记抗体,抗体过量抗体过量)IRMA放放射射性性核核素素标标记记放射性核素标记免疫分析优缺点：优缺点：自自19591959年年YalowYalow和和BersonBerso

14、n创建的放射免疫分析（创建的放射免疫分析（RIARIA）具）具有有灵敏度高、特异性强、简便实用、成本低廉灵敏度高、特异性强、简便实用、成本低廉等优点。为生等优点。为生物医学的微量物质分析开创了新的领域。发展到目前为止由物医学的微量物质分析开创了新的领域。发展到目前为止由此衍生出了各种各样的标记免疫分析技术。此衍生出了各种各样的标记免疫分析技术。虽然虽然RIARIA仍有较广泛的使用市场和价值，但其方法学上仍有较广泛的使用市场和价值，但其方法学上固有的弱点使发展受到一定限制。如必须使用放射性同位素固有的弱点使发展受到一定限制。如必须使用放射性同位素作为标记物，存在人为的因素影响较大、辐射防护及防止

15、污作为标记物，存在人为的因素影响较大、辐射防护及防止污染的问题，试剂盒使用时间短，可测量范围相对较窄，难以染的问题，试剂盒使用时间短，可测量范围相对较窄，难以实现操作及测量的自动化等。实现操作及测量的自动化等。酶标记免疫分析（EIA）概念：概念：是应用酶标记抗体（抗原）与抗原（抗体）是应用酶标记抗体（抗原）与抗原（抗体）产生特异性反应，根据酶对底物的显色反应而定产生特异性反应，根据酶对底物的显色反应而定量分析待测抗原或抗体含量。量分析待测抗原或抗体含量。分类分类:均相均相EIAEIA：酶增强免疫分析（：酶增强免疫分析（EMITEMIT）非均相非均相EIA:EIA:酶联免疫吸附分析法（酶联免疫吸

16、附分析法（ELASAELASA）时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)概念：概念：是应用镧系元素标记抗是应用镧系元素标记抗原或抗体，利用紫外线或激原或抗体，利用紫外线或激光使其发射荧光，结合波长光使其发射荧光，结合波长和时间两种分辨技术的微量和时间两种分辨技术的微量分析方法。分析方法。常用镧系元素：常用镧系元素：铕、铽、钐、镝铕、铽、钐、镝特点：特点：分析范围宽分析范围宽 灵敏度高灵敏度高专一度高专一度高稳定性强稳定性强1234发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析（CLIA）电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(ECLIA)化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析(CLEIA)分类

17、分类化学发光标记免疫分析（CLIA）化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法。化学发光免疫分析是将化学发光系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。发光Y YY磁微粒被测抗原+抗体+带吖啶酯标记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后（1）加入H2O2（pH10）化学发光标记免疫分析（CLIA）概念：概念：利用化学反应中释放大利用化学反应中释放大量自由能产生激发态中间量自由能产生激发态中间体，当其退激到基态时

18、，体，当其退激到基态时，发射出光子，对这些光子发射出光子，对这些光子量进行测量从而进行定量量进行测量从而进行定量分析抗原含量。分析抗原含量。常用发光剂：常用发光剂：鲁米诺类、吖啶酯类鲁米诺类、吖啶酯类特点：特点：灵敏度高灵敏度高特异性强特异性强重复性好重复性好测定范围宽测定范围宽1234化学发光酶免疫分析(CLEIA)是将是将高特异性的高特异性的酶标记免疫分析技术和具有高灵敏酶标记免疫分析技术和具有高灵敏度的化学发光分析技术相结合的一种标记免疫分度的化学发光分析技术相结合的一种标记免疫分析方法。析方法。发光剂：金刚烷发光剂：金刚烷特点：特点：标记结合稳定标记结合稳定发光持续时间长发光持续时间长

19、有利于测定有利于测定123辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(ECLIA)(ECLIA)简介：简介：是新一代标记免疫分析技术，与其它标记发是新一代标记免疫分析技术，与其它标记发光免疫分析的原理不同，是一种在电极表面由电光免疫分析的原理不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，采用更为理想化学引发的特异性化学发光反应，采用更为理想的标记物，使用磁性分离及电激发等新技术，进的标记物，使用磁性分离及电激发等新技术，进一步推动了发光免疫分析的发展，一步推动了发光免疫分析的发展，是目前最先是目前最先进的化学发光免疫测定系统。进的化学发光免疫测定系

20、统。电化学发光免疫分析(ECLIA)原理：原理：以电化学发光剂三联吡以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），与啶钌标记抗体（抗原），与待测标本中抗原（抗体）产待测标本中抗原（抗体）产生免疫反应形成复合物以三生免疫反应形成复合物以三丙胺丙胺(TPA)(TPA)为电子供体，在为电子供体，在电场中因电子转移而发生特电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括异性化学发光反应，它包括电化学发光和化学发光反应电化学发光和化学发光反应两个过程。两个过程。特点特点准确性好准确性好多元检测多元检测均相测量均相测量稳定性好稳定性好灵敏度高灵敏度高 在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体(抗

21、原)，用三联吡啶钌标记抗原(抗体)，在反应体系内待测标本与相应的抗体(抗原)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+为标记物为标记物三联吡啶钌为水溶性、高稳定性的小分子，可以确三联吡啶钌为水溶性、高稳定性的小分子，可以确保电化学发光的高稳定性，并

22、且无噪音干扰。保电化学发光的高稳定性，并且无噪音干扰。三联吡啶钌结构简单三联吡啶钌结构简单,分子量小，所以，易于标记到分子量小，所以，易于标记到任何物质（如抗原、抗体、核酸，等）上，并且任何物质（如抗原、抗体、核酸，等）上，并且对原物质的生物活性及免疫活性影响小。对原物质的生物活性及免疫活性影响小。TPATPA是是ECLECL中的电子供体中的电子供体，氧化后生成的中间产物是氧化后生成的中间产物是形成激发态形成激发态Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+化学能来源。化学能来源。电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(ECLIA)的标记物的标记物电化学发光免疫电化学发光免疫(ECLIA)(EC

23、LIA)反应模式图反应模式图电化学发光免疫分析测定示意图第四节第四节 体外标记免疫分析的质量控制体外标记免疫分析的质量控制质量控制的目的近期目的：近期目的：通过对测定结果的分析，对本次测定的质量作通过对测定结果的分析，对本次测定的质量作出评价，并按照预定的要求决定结果的取舍。出评价，并按照预定的要求决定结果的取舍。远期目的：远期目的：通过对不同批测定结果的比较，发现造成成误通过对不同批测定结果的比较，发现造成成误差的原因，从而改进实验条件或设计，以提高差的原因，从而改进实验条件或设计，以提高质量。质量。分析误差 *系统误差系统误差 标准品误差标准品误差 加样误差加样误差 测量误差测量误差 *随

24、机误差随机误差 样品的采集与制备样品的采集与制备质量控制指标 .精密度精密度 .准确度准确度 .灵敏度灵敏度 .特异性特异性.稳定性稳定性精密度用同一实验方法多次检测同用同一实验方法多次检测同一样品所得结果的一致性一样品所得结果的一致性，又称重复性。，又称重复性。常表示测量结果中的随机误常表示测量结果中的随机误差大小。差大小。常用变异系数、标准差值等常用变异系数、标准差值等表示。表示。准确度测定值与真值之间的符合程度测定值与真值之间的符合程度由系统误差和随机误差叠加决定由系统误差和随机误差叠加决定用回收率及健全性来评价用回收率及健全性来评价灵敏度测定方法的最小检测量测定方法的最小检测量影响因素

25、：抗体亲和力和特异性、标记品的比活度影响因素：抗体亲和力和特异性、标记品的比活度抗原的免疫原性以及反应方式和温育条件等。抗原的免疫原性以及反应方式和温育条件等。确定方法：零标准管法、确定方法：零标准管法、t t值检验法、粗略估计法。值检验法、粗略估计法。特异性决定于抗体对被测物质的专一性决定于抗体对被测物质的专一性常用交叉反应来表示常用交叉反应来表示稳定性指实验批间的重复性指实验批间的重复性常用最大结合率（常用最大结合率（B B0 0%）非特异性结合率（非特异性结合率（NSB%NSB%）标准曲线直线回归参数（标准曲线直线回归参数（a、b、r）标准曲线结合率（标准曲线结合率（EDED）等指标评价

26、）等指标评价质量控制评价系统实验室内部质量控制实验室内部质量控制(IQC)(IQC)实验室室间质量控制实验室室间质量控制(EQC)(EQC)包括从采集标本、收集、转运标本到发出报告的包括从采集标本、收集、转运标本到发出报告的全过程中，能及时发现检测过程中出现的各种全过程中，能及时发现检测过程中出现的各种误差，分析产生原因，找出解决办法，以确保误差，分析产生原因，找出解决办法，以确保检测质量。检测质量。检测、控制检测方法的精密度，并检测其准确度检测、控制检测方法的精密度，并检测其准确度的改变，提高常规测定工作的批间、批内检测的改变，提高常规测定工作的批间、批内检测结果的一致性。结果的一致性。实验室内部质量控制实验室内部质量控制(IQC)(IQC)实验室间质量控制(EQC)由第三方机构（质量控制中心）组织实施由第三方机构（质量控制中心）组织实施提高各实验室之间检测结果的可比性提高各实验室之间检测结果的可比性由一个单位提供方案及外部质量平价用的统一样由一个单位提供方案及外部质量平价用的统一样品，分发到各参加单位进行检测，然后将所得品，分发到各参加单位进行检测，然后将所得结果反馈于负责单位进行整理分析、评价，用结果反馈于负责单位进行整理分析、评价，用以促进检测质量的提高和资料的可比性。以促进检测质量的提高和资料的可比性。实验室间质量控制实验室间质量控制(EQC)(EQC)