第五章核酸的分离纯化PPT课件.ppt
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1、 核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础;内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子,是分子生物学和分子诊断的研究对象。DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸分离纯化的原则一、保持核酸一级结构的完整性二、尽可能提高核酸制品的纯度第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化提取提取DNADNA总的原则总的原则1 1 保证核酸一级结构的完整性;保证核酸一级结构的完整性;2 2 其他生物大分子如蛋白质
2、、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子分子的污染应降低到最低程度;的污染应降低到最低程度;3 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;剂和过高浓度的金属离子;4 4 其他核酸分子,如其他核酸分子,如RNARNA,也应尽量去除。,也应尽量去除。第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化第四节第四节 RNARNA的分离纯化的分离纯化第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化一、材料与
3、方法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择(一)材料与方法的选择(二)选择原则 (一)(一)材料与方法的选择材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求 需考虑制备核酸所需的时间与成本 应选择安全的试剂与制备方案 一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择 1、保持核酸碱基序列的完整性 2、尽量清除其它分子的污染,保证核酸纯度 3、保持核酸的完整性 应尽量简化分离纯化步骤,缩短提取时间 尽量避免各
4、种有害因素对核酸的破坏(二)选择原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计(一)核酸的释放(二)核酸的分离与纯化(三)核酸的浓缩、沉淀与洗涤(一)核酸的释放 DNA和RNA均位于细胞内(病毒除外),因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。二、技术路线的设计二、技术路线的设计表-各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母核酸分子抽提的技术设
5、计核酸分子抽提的技术设计核酸的释放:破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法(非机械法中溶胞法是应 用最广泛的方法)核酸的分离与纯化:将含有核酸分子复杂复合物中,将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物(蛋白质、多糖和脂 类分子)、非需要的核酸分子、试剂和溶液 应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物:蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子:分离某一特定的核酸分子 时,其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子(二)核酸的分离与纯化二、技术路线的设计二、技术路线的设计(三)核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸的最常用的方法 常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋
6、酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁 常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐,需用70%75%的乙醇洗涤去除二、技术路线的设计二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存(一)核酸的鉴定(二)核酸的保存(一)核酸的鉴定(一)核酸的鉴定1、浓度鉴定2、纯度鉴定3、完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 紫外分光光度法:该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线,其最大吸收波长为260nm。1、浓度鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保
7、存 荧光光度法:核酸的荧光染料溴化乙锭嵌 入碱基平面后,本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光,且荧光强度的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存EB与DNA的结合 紫外分光光度法:该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染,比值升高与 降低均提示不纯。在TE缓冲液中,纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.02、纯度鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存1.DNA1.DNA或或RNARNA的定量的定量ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于5050g/mlg/ml双链双链DNADNA40
8、g/ml40g/ml单链单链DNADNA(或(或RNARNA)20g/ml20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNADNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=1.8=1.8RNARNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=2.0=2.0三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存浓度鉴定浓度鉴定紫外分光光度法:测定紫外分光光度法:测定DNADNA在在A A260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。如计算如计算DNADNA浓度浓度 A A260260稀释倍数稀释倍数5050 g/mlg/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大
9、于紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸的核酸溶液。溶液。(A值等于1时,相当于50g/ml双链DNA,40g/ml单链DNA或RNA,20 g/ml单链寡核苷酸)荧光光度法:用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多,电泳迁移率低。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 荧光光度法 荧光染料溴化乙锭,可嵌入到碱基平面,而发出荧光,且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。(1-5ng)琼脂糖凝胶电泳法:以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大,在电场中泳动很慢,如果发生
10、降解,电泳图呈拖尾状。3、完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存DNADNA片段的降解片段的降解三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 完整或降解很少的总RNA电泳图谱中,三条带荧光强度积分应呈特定的比值,沉降系数大的核酸区带,电泳迁移低,荧光强度积分高;反之,分子量小,电泳迁移率高,荧光强度积分低。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 一般而言,28S(23S)RNA的荧光强度约为18S(16S)RNA的2倍,否则提示有RNA的降解。若 在点样孔附近有着色条带,则说明存在DNA 的污染。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 总总RNARNA电泳图谱电泳图谱三、核酸的鉴定
11、与保存三、核酸的鉴定与保存 正常时,正常时,28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍,否则提示倍,否则提示RNA的降解的降解(二)核酸的保存1、DNA的储存2、RNA的储存三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存1 1、短期贮存:、短期贮存:44或或-20-20存放于存放于TETE(tristris和和EDTAEDTA)缓冲液中。)缓冲液中。TETE缓冲液的缓冲液的PHPH与与DNA DNA 贮存有关,贮存有关,PHPH为为8 8时,可减少时,可减少DNADNA脱氨脱氨反应,反应,PHPH低于低于7.07.0时时DNADNA容易变性。容易变性。2 2、长期贮存:、长期贮
12、存:TETE缓冲液中缓冲液中-70-70保存数年;在保存数年;在DNADNA溶液中加一滴氯仿可有溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。效防止细菌和核酸的污染。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存(二)核酸的保存 _DNA的储存2、RNA的储存 RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中,-70保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin或VRC,保存时间可延长。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组 DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离 粗分离前处理离
13、子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收DNA酚抽提法示意图 一、酚抽提法一、酚抽提法 一、酚抽提法一、酚抽提法 该法于1976年由Stafford及其同事创立,现在使用的是改进的方法 以含EDTA、SDS及RNase裂解缓冲液裂解细胞 经蛋白酶K处理后,用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA,
14、获得DNA粗制品DNADNA样品准备样品准备 常见的标本:血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织:最好新鲜组织,若不能马上提取,应贮存 70或液氮主要试剂的作用:主要试剂的作用:EDTAEDTA:1 1 二价金属螯合剂,抑制核酸酶;二价金属螯合剂,抑制核酸酶;2 2 降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性SDSSDS的作用:的作用:1 1 溶解膜蛋白和脂肪,从而是细胞膜破裂;溶解膜蛋白和脂肪,从而是细胞膜破裂;2 2溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸 释放出来;释放出来;3 3 对对RNARNA、DNADNA酶有抑制作用;酶有抑制作用;4 4 与蛋白质形成
15、与蛋白质形成R-O-SO3 R-O-SO3.R.R蛋白质复合物,蛋白质复合物,使蛋白质变性。使蛋白质变性。蛋白酶蛋白酶K K:水解蛋白质的作用,消化水解蛋白质的作用,消化DNADNA酶和细胞中的蛋白质。酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶蛋白酶K K与其他蛋白酶相比,它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比,它具有更强的水解能力,而且在力,而且在SDSSDS、EDTAEDTA存在时仍保持较高活性,可存在时仍保持较高活性,可同时使用。同时使用。酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNADNA酶活性。酶活性。PH8.0PH8.0的的TrisTris溶液可以似的抽提出的溶液可以似的抽提出的DNA
16、DNA进入水进入水相,减少在蛋白质层滞留。相,减少在蛋白质层滞留。在酚或酚在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇,是可以氯仿中加入少许的异戊醇,是可以减少实验中的气泡的产生,而且利于分相,保减少实验中的气泡的产生,而且利于分相,保持分相的稳定性。持分相的稳定性。为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNADNA的分离?的分离?苯酚在空气中经常被氧化生成醌,它能够产生自由基,直接用于DNA分离,会使磷酸二酯键断裂,造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物,并用Ttis-Hcl饱和酚,并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液,降低DNA的损失率。DNADN
17、A的沉淀的沉淀1.无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等盐离子,作用是中和核酸分子表面等盐离子,作用是中和核酸分子表面的负电荷,有助于分子之间的聚集。的负电荷,有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水,使无水乙醇可以吸收分子之间的水,使DNA沉淀析出,无水沉淀析出,无水乙醇使用前冰冻,可以减少乙醇使用前冰冻,可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。的损伤。2.异丙醇沉淀异丙醇沉淀 除了使除了使DNA沉淀外,还可以溶解少量的小的沉淀外,还可以溶解少量的小的RNA分子。分子。DNADNA的浓缩的浓缩1、固体聚乙二醇(PEG)浓缩:
18、用透析袋外敷PEG至合适量。2、丁醇抽提浓缩:DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇,但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。DNADNA的检测的检测溴乙锭染色:在254nm紫外光下检测,如需回收最好在300nm紫外光下割胶,否则易使嘌呤断链,在1cm宽带上可检到10ng DNA。银染法:Ag+与DNA形成复合物,在甲醛还原下可染成黑褐色,灵敏度高200倍,但不能回收。二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法 19871987年年KupiecKupiec等报道了甲酰胺解聚法,等报道了甲酰胺解聚法,其中细其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法,但不进胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法,但不进行酚的抽
19、提。行酚的抽提。破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物,可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右 三三、玻棒缠绕法玻棒缠绕法 现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改进而来。DNA玻棒缠绕法示意图 三、玻棒缠绕法三、玻棒缠绕法四、其它方法四、其它方法 常用的一些分子诊断技术,并不需要高分子量的DNA样品,因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法运用而生并广泛使用 1.异丙醇沉淀法:仅用二倍容积异丙醇替代乙醇,可去除小分子R
20、NA(在异丙醇中可溶状态)2.玻璃珠吸附法五五、DNADNA片段的纯化片段的纯化 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法(column chromatography)DNA柱层析法柱层析法示意图示意图五、五、DNADNA片段的纯化片段的纯化六、六、DNADNA片段的回收片段的回收原则与要求:1.提高片段的回收率;2.清除回收的DNA样品中的杂质。六六、DNADNA片段的回收片段的回收(二)从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段(一)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法2.电泳洗脱法3.冷冻挤压法4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法(一)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段六
21、六、DNADNA片段的回收片段的回收电泳到电泳到DEAE-DEAE-纤维素膜纤维素膜 :DEAEDEAE是一种阴离子交换纤维素,可以吸附带有是一种阴离子交换纤维素,可以吸附带有负电荷的负电荷的DNADNA分子。分子。在所需条带前插入在所需条带前插入DEAT-DEAT-纤维素膜,继续电泳纤维素膜,继续电泳至条带至条带DNADNA都到膜上,取出洗下。都到膜上,取出洗下。500bp-5kb500bp-5kb的的DNADNA片段回收率较好,纯度高。片段回收率较好,纯度高。但但不适用于分子量超过不适用于分子量超过10kb10kb和单链和单链DNADNA。透析袋电洗脱透析袋电洗脱 :切下条带的琼脂糖凝胶,
22、放透析袋内,加缓冲液切下条带的琼脂糖凝胶,放透析袋内,加缓冲液后继续电泳,后继续电泳,DNADNA出胶后进行抽提出胶后进行抽提DNADNA回收。回收。低熔点琼脂糖凝胶:低熔点琼脂糖凝胶:切下胶,加热到切下胶,加热到6565熔化胶,然后抽提回收熔化胶,然后抽提回收DNADNA。方法:有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂方法:有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。水解酶等。玻璃珠洗脱法:将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化玻璃珠洗脱法:将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液,然后加入玻璃珠结合钠溶液,然后加入玻璃珠结合DNADNA,经分离、,经分离、洗涤后,在低盐缓冲液中将洗涤后,在低盐缓冲液中将DNAD
23、NA洗脱下。洗脱下。琼脂水解酶:将含琼脂水解酶:将含DNADNA的凝胶进行消化,琼脂糖水解的凝胶进行消化,琼脂糖水解成二糖,释放成二糖,释放DNADNA,后使用酚抽提方法回收,后使用酚抽提方法回收DNA DNA(二)从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。虽费时但操作简单,是小片段DNA回收的较好方法。六六、DNADNA片段的回收片段的回收 至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段,又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。六六、DNADNA片段的回收片段的回收 质粒简介质粒简介质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的
24、小环质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状状DNADNA分子分子 其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200kb200kb以上不等以上不等 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复 制和遗传的辅助性遗传单位制和遗传的辅助性遗传单位 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值,而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术 质粒特性质粒特性1.1.分子相对小分子相对小 2.2.含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分 3
25、.3.不相容性不相容性4.4.转移性转移性5.5.选择的标记选择的标记6.6.限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口常用质粒载体常用质粒载体pBR322pBR322 pBR322pBR322是一种使用最广泛的质粒,全长为是一种使用最广泛的质粒,全长为4363bp4363bp,由,由3 3种野生型质粒成分组成,种野生型质粒成分组成,ampampr r基因来自基因来自pRSF2124pRSF2124,tettetr r来自来自pSCl01pSCl01,复制起始点来自,复制起始点来自pM9pM9。核苷酸的序次。核苷酸的序次号,以号,以EcoRIEcoRI序列序列GAATTCGAATTC的第一个的第
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