细胞融合方法应用课件.ppt

1、 细胞融合 1 第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述2一、细胞融合的定义细胞融合细胞融合(cell fusion)就是指在外力（诱导剂或促融剂）作用下，两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合，并形成杂种细胞的现象，也称细胞杂交（cell hybridization）。3 细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生

2、物学，特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。4二、细胞融合的研究进展Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田善雄（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应

3、。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。5三、细胞融合的意义理论上说，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合，使远源杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。这种手段打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质重组的范围。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程

4、中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。6 第二节第二节 细胞融合常用的方法细胞融合常用的方法7按促融剂的不同分为 生物法 化学法 物理法8一、生物法 1958年日本学者冈田善雄首先观察到血凝性病毒（HVJ）可引起小白鼠腹腔中的艾氏腹水瘤细胞（ETC）的融合。冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础，这使得病毒类成为研究最早的促融剂。9 一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合，但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上收到很大的限制，由此科研人员试图尝试使用灭活的病毒来作为促融剂。1965年，英国Harris等成功的运用灭活的病毒作为促融剂诱导细胞融合，并且产生的

5、杂交细胞可以存活。10仙台病毒（HVJ）诱导法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞膜上，并使两细胞相互凝聚；在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0-8.2；细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；融合成巨大细胞，仍需ATP。11病毒促使细胞融合的主要步骤如下1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；3.两个原生质体或细胞的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；4.进入正

6、常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。1213用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 病毒法的一些缺点 利用灭活的病毒诱导细胞融合，存在着许多问题，如病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。14二、化学法 盐类融合法：此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法，对原生质体的破坏小。高钙和高PH值融合法：Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得l00余株体细胞杂种。提高该方法的使

7、用范围是亟待解决的问题。15 聚乙二醇（PEG）融合法：1974年华裔加拿大籍科学家高国楠(Kao)发现PEG可促进不同科属的植物原生质体之间的融合当加入一定分子量的PEG时，融合效率较病毒诱导法提高1000倍以上。16聚乙二醇诱导法（PEG）聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50%PEG溶液能产生最多杂交细胞。PEG诱导细胞融合的有效范围50%55%。PEG溶液在pH 6.0时细胞融合率最高。17聚乙二醇诱导法（PEG）原理：高国楠（Kao）等认为，由于PEG分子

8、具有轻微的负极性，故可以与具有正极性的基团水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。18聚乙二醇（PEG）诱导法的步骤1.将两种不同亲本细胞各取5l06个混匀；2.离心沉淀，吸去上清液；3.加1ml 50%PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；4.加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；5.加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养液至 5ml，37的CO2培养箱中培养；6.624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。1920聚乙二

9、醇（PEG）诱导法的优缺点 优点：优点：此法比病毒更易制备，活性稳定，融合成本低，无需特殊设备，融合率较高；融合过程没有种间、属间、科间的特异性或专一性。缺点：缺点：聚乙二醇诱导细胞融合的有效浓度（50%55%）对细胞毒性很大，融合率较低及经验性大等缺陷。21三、物理法 电脉冲诱导细胞融合技术 激光融合技术 空间细胞融合技术 离子束细胞融合技术 非对称细胞融合技术221、电脉冲诱导细胞融合技术 电融合的原理电融合的原理：电融合法是在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状，当可逆电击穿发生在2个相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融

10、合，从而导致细胞融合。电融合法的优点电融合法的优点：u融合率高、是PEG的100倍，重复性强、对细胞伤害小；u装置精巧，方法简单、快速，可在显微镜下观察观察融合过程；u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。23电融合的基本步骤 细胞膜的接触：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串。膜的击穿：膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。24 电融合法示意图电融合法示意图252、激光诱导法 利

11、用激光的光镊建立细胞间接触激光微束可以对相邻细胞的接触区细胞进行破坏，从而诱导许多细胞中所需的2个相邻细胞融合。优点优点：与前面几种方法相比，最突出的优点在于它的高度选择性，可选择任意2个细胞进行融合，易于实现特异性细胞融合，作用于细胞的应力小，定时、定位性强，损伤小，参数易于控制，操作方便，可利用监控器清晰地观察整个融合过程，实验重复性好，无菌，无毒。缺点缺点：此法只能逐一处理细胞，不能像其他方法一样同时处理大量细胞。263、空间细胞融合技术 背景背景：由于地球引力的存在，有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞间的融合得率十分有限。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，由

12、于无法排除地球引力的影响，要提高淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。在空间的微重力环境下，细胞融合得率明显增加，主要是降低了重力沉淀影响。274、离子束细胞融合技术 原理原理：在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变。据此原理，发展了离子束诱导细胞融合技术。由于用于辐照的离子束的参数除了能量可调外，离子种类、电荷、质量皆可调，因此，离子束的可操纵性强，可以用微束对细胞进行超微加工，有目的地切割染色体用于基因工程和细胞工程，通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。285、非对称细胞融合技术 非对称细

13、胞融合技术，是利用某种外界因素(常为射线，即融合)辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核，并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体，选择性地使其细胞质失活。然后融合来自这2个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合。或者使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。29 第三节第三节 细胞融合技术的应用细胞融合技术的应用30一、微生物细胞融合技术的应用 微生物细胞融合技术一方面用于生物药品的生产，包括抗生素、生物活性物质、疫苗等；另一方面为发酵

14、工业提供优良菌种，如酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交，分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。31二、植物细胞融合技术的应用 基础理论研究 培育抗性植株 培育新型植株 应用于种质保存和有用物质生产321、培育抗性植株 Shelley用马铃薯二倍体作亲本经过体细胞杂交得到抗科罗拉多马铃薯甲虫的四倍体体细胞杂种；Bastia等对耐霜冻的野生种和栽培种进行体细胞杂交，获得的所有体细胞杂种都比栽培种亲本耐霜冻，其中有3株比野生种亲本的耐性还高。332、培育新型植株343、应用于种质保存和有用物质生产 目前可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体，从而有可能引起细胞遗传性的改

15、变，为某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮提供可行的方法，还可应用于种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产。35三、动物细胞融合的应用 用于研究细胞的核质关系 用于解释疾病的发生机制 用于基因定位研究 用于衰老机制的研究 用于生产单克隆抗体 动物细胞融合用于动物育种361、用于研究细胞的核质关系 Prescott等1972年首先应用离心术结合细胞松弛素B分离哺乳类动物细胞的胞质体获得成功，为研究哺乳类细胞的核质关系、细胞质基因的转移开创了新途径。372、用于解释疾病的发生机制 细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法细胞融合技术与显微技术相结合可以研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系。Latt

16、anzi等将细胞融合技术与免疫荧光、生化分析、电镜技术相结合，对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究并取得较大的进展。383、用于基因定位研究 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise等发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，利用这一特点可以对人染色体上的基因进行定位。394、用于衰老机制的研究 Tam等采用细胞融合的方法在干细胞研究中揭示了衰老的分子机制：衰老是一个可逆的过程，它决定于直接或间接控制端粒长度及端粒酶活性的生物分子之间的平衡作用，通过改变染色质的状态进而进行表观遗传修饰调节基因表达。4

17、05、动物细胞融合用于动物育种 动物体细胞融合后，杂种细胞一般难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育出新的杂种。416、用于生产单克隆抗体42什么叫单克隆抗体 单克隆抗体(monoclonal antibody，简称McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。4344单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细

18、胞融合、细胞融合、筛选筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选筛选，继续培养，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体45亲本细胞的选择 骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT-或TK-。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞。选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）46 淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：体内法或体外法。体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福

19、氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3-4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95以上的可以用于融合。体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3-4天后，收集被刺激的淋巴细胞。47细胞融合 将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7-10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层。在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5-10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置

20、10分钟。48HAT培养基筛选杂交瘤细胞 细胞团块分散后，加HAT溶液，稀释至骨髓瘤细胞不超过2105 个/ml，即可加入饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。用HAT选择性培养时每隔2-3天半量换液，7天后可以选择出杂交瘤细胞。49HAT选择系统 HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种。50 杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。H

21、PRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生；TK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。51 淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。在HAT培养基中，HPRT-或TK-，亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。52特异性杂交瘤细胞的筛选 通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶标测定、间接血凝等方法测

22、定。细胞抗原可采用免疫荧光、51Cr释放试验、溶血空斑测定、补体依赖的细胞毒等方法直接测定针对这些抗原的抗体。5354利用培养基对单抗进行鉴定的过程单克隆抗体的应用55单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医 学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低 生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术。有望的潜在技术。单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不断发展。医学的不断发展。Thank you!56