红细胞渗透脆性与白细胞染色实验总结课件.ppt
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1、红细胞渗透脆性试验 与羊血白细胞染色药学药学2班班 陈旭宇陈旭宇 李佳朋李佳朋讲解内容实验概述实验概述预实验情况预实验情况正式实验情况正式实验情况创新实验创新实验实验概述 一、实验目的1、观察不同浓度的低渗盐溶液对红细胞的影响,加深理解细胞外液晶体渗透压相对稳定对维持细胞正常形态与功能的重要意义。2、掌握白细胞染色的方法,理解瑞氏染液的作用。二、实验原理红细胞渗透脆性实验开始出现溶血现象的低渗盐溶液浓度为该血液红细胞的最小抵抗力开始出现完全溶血时的低渗盐溶液的浓度则为该红细胞的最大抵抗力器材及药品:小试管、试管架、微量移液管(1000uL与200uL两种规格)显微镜、载物玻璃片、170mmol
2、/L NaCl溶液实验对象:抗凝羊血 (抗凝血剂为柠檬酸钠)预实验情况预实验情况 预实验目的:1、观察不同浓度的低渗盐溶液对红细胞的影响,加深理解细胞外 液晶体渗透压相对稳定对维持细胞正常形态与功能的重要意义 2、熟练白细胞染色的操作,理解瑞氏染液、吉姆萨染色的作用 3、查阅相关文献,加深对实验的理解,掌握更全面信息 4、总结实验的一些注意事项和操作技巧,预知实验可能出现的问题,做好应对措施 5、清楚实验的大致结果,给同学们作为参考染色原理:血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质,与酸性染料伊红结合,染粉红色,称为嗜酸性物质;细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染
3、紫蓝色或蓝色,称为嗜碱性物质;预习探究一:由于开始的两次实验,我们都习惯先将羊血存于冰箱中保存,然后取出再在室温下实验。考虑到正式实验当天,我们会使用刚取回的羊血(未经冰箱冷却实验)进行试验。考虑到这些温度和时间上的差异,我们有必要进行模拟实验,来探究正式实验环境下的合理范围。试管号试管号试液试液1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010170mmol/LNaCl170mmol/LNaCl(mlml)1.41.41.31.31.21.21.11.11.01.00.90.90.80.80.70.70.60.60.50.5蒸馏水(蒸馏水(mlml)0.60.60.70.70.8
4、0.80.90.91.01.01.11.11.21.21.31.31.41.41.51.5NaClNaCl浓度(浓度(mmolmmol/L/L)1201201121121041049595868678786969606052524343表表1 1:各种低渗盐溶液的制备:各种低渗盐溶液的制备实验温实验温度度/离体时间离体时间/h/h最大抵抗力组最大抵抗力组别别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度(度(mmol/lmmol/l)最小抵抗力组最小抵抗力组别别最小抵抗力浓最小抵抗力浓度(度(mmol/lmmol/l)18181 17 769695 5868619193 37 769694 4959522225
5、56 678783 310410420208 85 586863 3104104191912124 495953 3104104171724243 3104104表2:第一次取血红细胞渗透脆性实验结果 表3:第二次取血红细胞渗透脆性实验结果 实验温实验温度度/离体时间离体时间/h/h最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度(度(mmol/lmmol/l)最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力最小抵抗力浓度(浓度(mmol/lmmol/l)17171 17 769695 5868620203 36 678784 4959522225 56 678783 310410421218 8
6、5 586863 3104104171712124 495953 3104104151524243 3104104 表4:第三次取血红细胞渗透脆性实验结果 实验温实验温度度/离体时间离体时间/h/h最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度(度(mmol/lmmol/l)最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力最小抵抗力浓度(浓度(mmol/lmmol/l)19191 17 786865 5868621213 36 678784 4959525255 56 678784 4959523238 85 586863 3104104212112125 586863 310410420202
7、4243 3104104结论:1、血红细胞离体时间越长渗透脆脆性越大;2、实验室内同一天内的温度变化在 1528范围内,对实验结果影 响不明显。3、羊血不经冰箱储存冷却,在实验室温度环境下,离体35h,预计实验结果为:最小抵抗力浓度:95104mmol/L最大抵抗力浓度:6978mmol/L实验操作总结:(供以后实验同学们参考)a.溶液用前应现配,以免水分蒸发,改变离子浓度。b.溶血的结果判断,应首先在室温下静置一个小时湖再观察结果,先从高浓度观察,上层初现透明红色为开始溶血管,溶液透明深红色、管底红细胞完全消失者为完全溶血。如不易判断可低速离心1分钟后观察。c.器材必须清洁干燥,避免引起其他
8、异物影响所致溶血。d.红细胞脆性实验中,可以先向每个试管中加氯化钠然后再加蒸馏水,加的时候还有个小技巧,以氯化钠为例,先将几个大于1000uL的试管中都加上1000uL的氯化钠,然后再按900,800到100uL递减的顺序依次加这样可以节省时间 e.血必须直接注入试剂中,不可沿着管壁。试验中我们直接用的滴管取血,可能试管中的血量有差距,建议后面用微量移液器定量取血排除观察溶血状况时,血量不同带来的影响 f.血液和盐溶液时不要用力震荡,静置及观察时不要移动试管。g.染色必须得等到血片干燥后进行,否则染不上色 h.血膜的冲洗时水流不能太急,防止将血膜冲掉,应用蒸馏水冲血片的上方,然后滑落下的水流冲
9、洗血膜实验2:细胞染色实验药品准备:缓冲液配制:1%KH2PO4+1%NaHPO4(20ml),加水至1000ml,置室温黑暗处,瓶口密封,防止霉菌污染。姆萨染液配制:药品:吉姆萨染料(粉末)0.5g、甲醇(AR)33ml、甘油(AR)33ml 方法:先将吉姆萨染料放入研钵中,逐渐到甘油研磨溶于甘油中,置于58水温箱内90-120min,然后加入甲醇,摇匀后放置数天,过滤后或不过滤即可使用。(此染液放置室温阴暗处,时间越长越好)(2)实验过程 开始时,一切从零开始,我们的血片制备很不合格,要么过厚,要么不均匀。在耿姝学姐手把手讲解之后,我们不耐其烦,连续联系制作了近30个血片,终于能够制作出厚
10、度适宜,效果成功的血涂片,并掌握了制片的技巧。联系生物实验一中白细胞计数时应用白细胞液破坏红细胞的经验,我们在染色之前对血液使用白细胞稀释液排除干扰,但是染色结果与不加白细胞染色液相比反而较差,影响染色效果。分析原因有可能是白细胞染色液引起了PH的改变,或产生液膜稀释了染液,最后否定了加白细胞稀释液进行染色的方案。经验总结推片经验:用移液枪头沾取羊血点置于载玻片上,呈米粒大小,将推玻片保持与载玻片约30度角,置于血滴正前方,稍往后移与血滴接触,即可见血液沿推片下缘散开,再匀速沿载玻片平面平稳向后滑动,至血膜铺匀。图1 瑞氏染色法 图2 吉姆萨氏染色法 通过预实验总结出的各染色法染色效果:瑞氏染
11、色法:白细胞核、细胞浆层次分明,嗜中性白细胞浆中可见淡红色染色颗粒。吉姆萨氏染色法:白细胞核呈蓝色,层次清楚。瑞吉复合染色法:白细胞层次清晰,细胞浆中染色颗粒可见。正式实验 实验准备:我们在周三下午将PPT交与李老师征求修改意见,并在当天晚上修改完毕。于周四晚上,准备好实验所需各项仪器与药品,并写好板书。周五早上上课前取回羊血。实验过程:实验过程无迟到、旷课、早退现象,同学们热情度很高,认真实验。对同学的操作过程进行严格把关,使绝大多数同学的实验取得了预期的结果,其中章梦甜、陶倩组白细胞染色观察效果非常好,能观察到多个白细胞清晰镜像。白细胞染色出现问题主要为以下几点:1、血膜涂得过厚,造成观察
12、困难;2、对染液进行冲洗时不彻底,造成着色过深,出现一大片蓝的现象;3、冲洗过猛,观察不到白细胞。在老师和我们的帮助下,同学们很好解决了这些问题。掌握好染色时间、染液量和染液冲洗是关键不好,上图为典型的染液冲洗不好的结果实验报告批改情况 存在的问题与不足:漏写:有些同学实验仪器及药品未写全;或厂家未标注;实验室温度湿度等环境记录;实验原理未写或写的不全面。讨论:实验结果分析不到位;实验操作中的讨论过于宽泛;文献内容过多引用,缺乏自己的语言;一些讨论不够严谨,理论支持太少。创新:创新方面未结合实验室实际情况,有些不实用。有不少同学在报告中反映瑞士染色效果好于吉姆萨染色,这可能是由于正式实验中所使
13、用吉姆萨染液比较新的原因。在吉姆萨染液放置一个月后,染色效果有很大提高,在我组后期染色操作中发现,吉姆萨染色效果要优于瑞氏染液,因此总结到经验:吉姆萨染液最好提前一个月配置,暗处放置。创新实验1、进一步探究温度、离体时间对红细胞形态及渗透脆性 的影响;2、利用紫外分光光度计测不同地深盐溶液中的溶血度;3、探究白细胞染色片中的蓝紫色小颗粒聚集物来源4、改良白细胞染色方法一、探讨离体时间、温度对红细胞形态及渗透脆性的影响 红细胞渗透脆性受细胞膜结构、细胞膜流动性、以及红细胞几何特性及红细胞膜抗张强度等多个因素的影响,其中与红细胞表面面积和体积的比值有很大关系。通过批阅报告,我们发现大多数同学没有对
14、不同浓度低渗盐溶液中的血红细胞进行镜检,而且往届助教也没有进行形态变化的观察。1.2 方法:对三次取的羊血材料分别进行了相同的实验操作。取适量新鲜羊血(A液)分别置于4个洁净烧杯,标号A1.A2.A3.A4。实验过程中,各组羊血、低渗盐溶液、A滴入B、均匀、静置、观察各步骤均在各自的恒温环境中进行。表6 各种低渗盐溶液(B液)的制备试管号试液12345678910170mmol/LNaCl(mL)1.41.31.21.11.00.90.80.70.60.5蒸馏水(mL)0.60.70.80.91.01.11.21.31.41.5NaCl浓度 (mmol/L)120112104958678696
15、052431下羊血红细胞均出现表面凹凸不平,呈不规则球形。有萎缩趋势。红细胞变化明显,细胞膜结构变形严重,易发生溶血。联系生物化学知识,降低温度会抑制细胞各类酶的活性,如呼吸酶、转氨酶等。导致细胞生物活性降低。细胞膜通透性能改变,红细胞脆性增大。室温下羊血红细胞的变化比较明显,部分细胞形状变化严重,大多变瘪,甚至有镰刀状红细胞出现。可以推断在正中情况下检测出的红细胞脆性肯定与在体的规则球形红细胞的渗透脆性不同。38下保存的羊血红细胞变化情况不如25的明显,但是依然可以看出红细胞已经发生变形,表面凹凸不平,呈现不规则块状、椭圆状、三角状。51下保存的羊血红细胞发生严重的变形。大多数红细胞变瘪,呈
16、镰刀状或飞碟状。我们推测高温使血液蒸发失水,血液中离子等溶质浓度升高,渗透压增大,导致红细胞失水变瘪。在加入少量 51蒸馏水稀释后,部分细胞干瘪情况减轻,形状又恢复,但仍有许多飞碟状、镰刀状细胞。可见这种变化是多方面的,高温对红细胞的活性产生了不可逆的影响。表7.离体3h不同温度下的羊血红细胞脆性标号标号实验温度实验温度/最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度(度(mmolmmol/L/L)最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力浓度最小抵抗力浓度(mmolmmol/L/L)A1A11 16 678785 58686A2A225256 678784 49595A3A338386
17、678785 58686A4A451516 678785 58686 表8.离体5h不同温度下的羊血红细胞脆性标号标号实验温度实验温度/最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度(度(mmolmmol/L/L)最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力浓最小抵抗力浓度(度(mmolmmol/L/L)A1A11 16 678784 49595A2A225256 678784 49595A3A338386 678785 58686A4A451516 678785 58686 表9.离体12h不同温度下的羊血红细胞脆性标号标号实验温度实验温度/最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗
18、力浓度(度(mmolmmol/L/L)最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力浓最小抵抗力浓度(度(mmolmmol/L/L)A1A11 16 678784 49595A2A225256 678784 49595A3A338386 678785 58686A4A451516 678785 58686 表10.25 下探究更准确的最大最小抵抗力试管号试管号试液试液1 12 23 3 4 45 56 67 78 8170mmol/LNaC170mmol/LNaCl l(mlml)1.281.281.261.261.241.241.221.221.081.081.061.061.041.041.021
19、.02蒸馏水(蒸馏水(mlml)0.720.720.740.740.760.760.780.780.920.920.940.940.960.960.980.98NaClNaCl浓度(浓度(mmolmmol/L/L)1091091071071051051041049292909088888787实验结果 1、2、3、4、5、6管皆为上层透明红色,下层浑浊红7、8管为透明红色1.4得出结论:温度对红细胞的形态有影响,其中高温(51)对红细胞形态影响最大;相同温度下,红细胞的脆性随时间的增长而变大;相同时间下,1和51下红细胞脆性变大速度较室温和体温快,温度偏离体温程度越大,越容易使红细胞脆性增大;
20、保存环境的温度对红细胞的形态有很大影响。实验2、红细胞在不同浓度低渗氯化钠溶液中溶血率的测定 2.1概述:传统的测定方法采用目测观察其溶血情况,需要静置一小时后观察,观察过程中不能晃动。此法仅能观察到溶血的大致情况,不能量化红细胞破裂的程度。本试验采用分光光度法精确测定红细胞在低渗氯化钠溶液中的溶血情况。进一步了解血红蛋白的脆性。2.3实验步骤 2.3.1配制不同浓度低渗氯化钠溶液 取口径相同、清洁干净的小试管做好编号,制成不同浓度的低渗盐溶液,每管总量为3.0mL,第11管为蒸馏水,具体配制情况见如下表所示:试管号试管号试液试液1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101
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