生物制药抗体课件.ppt
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- 生物制药 抗体 课件
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1、抗体药物抗体药物张忠山第三节第三节 鼠源性单克隆抗体的改进鼠源性单克隆抗体的改进 改造鼠源性单克隆抗体的目的:一是降低免疫原性;二是降低相对分子量,增加组织通透性。如将鼠源性单克隆抗体的C区用人的Ig分子的C区置换,则对人的免疫原性消失。对鼠源性抗体的改造已有很多成果报道,见书中表4-4,给出了改造后的单抗的类型和特性。一、人一、人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 制备方法:提取杂交瘤细胞系的mRNA,经过逆转录成cDNA,并以其为模板,采用特异引物,用PCR方法分别扩增VL和VH基因,再分别连接真核表达所需的上游启动子、前导肽序列和下游剪切供体信号、增强子真核调控序列后,将VL基因克隆到人Ig的CL基
2、因表达载体上,将VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表达载体上,再将人-鼠嵌合的V-C区基因质粒DNA等量混合,在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP2/0,转染后用含霉酚酸进行筛选,形成集落的细胞即为共转染细胞,所分泌的抗体为嵌合抗体。它保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性,但对人的免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替换鼠IgG1或IgG2b,则可有效地加强多肽的ADCC效应与免疫调理作用。二、改形抗体二、改形抗体 如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列,则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源性部分只占很小比例,可基本消
3、除免疫原性。这种改形抗体(reshaping antibody)又称CDR移植抗体(CDR grafting antibody)。书中表4-5给出几种改形抗体及其潜在的临床应用。三、小分子抗体三、小分子抗体 基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段,其相对分子量仅为原抗体的1/80-1/3。也就是说,保留了CDR区,而Ig分子的C区不表达。现在研制的小分子抗体有以下几种类型:(1)Fab抗体,由完整的轻链和重链(VH和CH1)所组成。(2)FV抗体,由VH和VL组成,天然FV片段中VH和VL为非共价性结合。(3)单链抗体(single chain antibody SCA 或sing
4、le chain FV,SCFV),由VH和VL通过一段连接肽(linker)连接而成的重组蛋白。有分子量小、穿透力强、免疫原性小特点,可与效应分子相连接构建新功能抗体分子,是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。(4)单域抗体,由VH(VL)单个可变区组成的,只有抗体分子的1/12,而且表面疏水性强,与抗原非特异结合能力也强。(5)最小识别单位(MRU)是由单个CDR区构成的小分子抗体,亲和力较低。四、双功能抗体四、双功能抗体 双功能抗体就是双特异性抗体(biospecific antibody,BsAb)。它是一种非天然性的抗体,其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。1、化学交联法 2、生物学
5、方法(杂种-杂交瘤)杂交瘤细胞与脾细胞融合得到可分泌两种亲代抗体和杂种抗体的 杂种-杂交瘤细胞。3、基因工程方法 采用适当的接头连接不同抗体的VH和VL区,使它们不能形成链内的分子内配对,让其形成原抗体的分子内配对,构建双特异性(SCFV)2。五、抗体融合蛋白五、抗体融合蛋白 抗体的一部分被非抗体序列替代,所形成的融合蛋白具有新特性,称之为抗体融合蛋白。类型有:(1)配基-配基型融合蛋白,如CD4-Fc。(2)配基-Ig嵌合型蛋白,如IL-2-Ig。(3)配基-FV型嵌合蛋白,如CD4-FVCD3。(4)受体-FV型融合蛋白。(5)酶-抗体型融合蛋白。其中较为成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白,而酶
6、-抗体型融合蛋白(即抗体酶,abeneyme)在药物治疗中应用前景广阔,它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物,避免对正常组织的伤害,此法称为抗体介导的酶前体药物治疗。构建抗体融合蛋白的原则是:将第一个蛋白的终止密码子删除,再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因,即可实现两个基因共表达。噬菌体抗体库技术的原理,简言之就是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗体基因的存在,同时在其表面又有抗体分子的表达,就可以方便地利用抗原抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体,并进行克
7、隆扩增。第四节第四节 抗体工程抗体工程 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1、获得目的基因 2、抗体库技术的载体:现在普遍使用噬菌粒(phagemid)载体,其中的pHEN1为新一代载体,转化效率高,有利于提高库容量。3、淘筛:抗原固定化后,对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增,与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库,再反复与抗原吸附,经几轮淘筛后,淘汰了非目的克隆,且使目的克隆大量扩增。4、表达与鉴定:目的克隆经过鉴定后,再导入感受态菌株,进行可溶性表达,其产物用western blot分析确定后,就完成了全过程。二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库
8、抗体文库1011库容,能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增,使用的通用引物采自多个人体,具有人的种属普遍性。VH和VL随机重组增加抗体的多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术 3、可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库中,VH 和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程,所用抗体基因又都是来自人体,因此产生的抗体必然都是高亲和力的。三、基因工程抗体的表达三、基因工程抗体的表达 1、原核细胞表达:融合表达、分泌型表达 2、真核细胞表达 3、转基因植物表达 4、转基因动物表达 融合表达:表达载体的多克隆位点上有一段融
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