生物化学实验甲SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量课件.ppt

1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量1.1、原理、原理 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带静电荷的多蛋白质组分的分子大小和形状以及所带静电荷的多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。蛋白质分子少等因素所造成的电泳迁移率的差别。蛋白质分子在外加电场下的泳动行为可用下列函数式表示：在外加电场下的泳动行为可用下列函数式表示：EQV=6rv：分子泳动速度：分子泳动速度 Q：分子所带净电荷：分子所带净电荷E：电场强度：电场强度 r：分子半径：分子半径：介质粘度介质粘度SDS聚

2、丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基磺酸钠（烷基磺酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量的大小，而其它因素对电泳主要取决于它的分子量的大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。迁移率的影响几乎可以忽略不计。SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。分子团的混合形式存在。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白

3、质的分子量 这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象，特别是在强还原剂，如巯基乙醇原有的空间构象，特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原，从而存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原，从而保证了蛋白质分子与保证了蛋白质分子与SDS能充分结合，形成带负电能充分结合，形成带负电荷的蛋白质荷的蛋白质-SDS复合物。复合物。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 这种复合物由于结合了大

4、量的这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。分子之间天然的电荷差异。SDS与蛋白质结合后，还会引起蛋白质分子发生构与蛋白质结合后，还会引起蛋白质分子发生构象的改变，使蛋白质复合物在水溶液中的形状近似象的改变，使蛋白质复合物在水溶液中的形状近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物复合物的短轴长度都一样，约为的短轴长度都一样，约为1.8nm

5、，长轴则随蛋白质，长轴则随蛋白质分子量成正比变化。分子量成正比变化。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。的长度，也就是蛋白质分子量的函数。当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在15000200000D之间时，蛋白之间时，蛋白质分子的电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，质分子的电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下列方程式：符合下列方程式：SD

6、S聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 lgMw=-b mR +K Mw：蛋白质的分子量：蛋白质的分子量 mR：相对迁移率：相对迁移率 b：斜率斜率 K：截距：截距 当条件一定时，当条件一定时，b，K 均为常数，即此时均为常数，即此时lgMw 与与mR的关系为线性关系，的关系为线性关系，如以如以lgMw对对mR作图，应作图，应 得到一条直线，如右图：得到一条直线，如右图：lgMwmR待测待测mR待测待测lgMwSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 如将已知分子量的几种标准蛋白质的相对迁移率对如将已知分子量的几

7、种标准蛋白质的相对迁移率对分子量作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在分子量作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得该蛋白质的分子量。标准曲线上求得该蛋白质的分子量。电泳用的支持介质为凝胶，常用的有聚丙烯酰胺凝电泳用的支持介质为凝胶，常用的有聚丙烯酰胺凝胶胶(PAGE)和琼脂糖凝胶（和琼脂糖凝胶（agarose）。本试验用聚）。本试验用聚丙烯酰胺凝胶。丙烯酰胺凝胶。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（单体，聚丙烯酰胺凝胶

8、是由丙烯酰胺（单体，Acr）和甲）和甲叉双丙烯酰胺（双体，叉双丙烯酰胺（双体，Bis）在催化剂（）在催化剂（TEMED）和引发剂（和引发剂（AP或或VitB2）作用下聚合而成的三维网）作用下聚合而成的三维网状结构的凝胶。状结构的凝胶。单体和双体单独存在或混合在一起都是相对稳定的，单体和双体单独存在或混合在一起都是相对稳定的，若有自由基存在则可引发二者的聚合。若有自由基存在则可引发二者的聚合。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 自由基引发的方式有化学法和光化学法两种，前者自由基引发的方式有化学法和光化学法两种，前者的引发剂是过硫酸胺（的引发剂是过硫

9、酸胺（AP），后者的引发剂是核），后者的引发剂是核黄素（黄素（VitB2）。两种方法的催化剂都是四甲基乙）。两种方法的催化剂都是四甲基乙二胺（二胺（TEMED）。）。在一定浓度范围内，改变聚合体系中在一定浓度范围内，改变聚合体系中Acr和和Bis的比的比例，可得到不同网眼大小的凝胶，由于凝胶的三维例，可得到不同网眼大小的凝胶，由于凝胶的三维网状结构，对在凝胶中泳动的不同分子量的质点有网状结构，对在凝胶中泳动的不同分子量的质点有着选择和阻碍，因此使凝胶本身又具有分子筛效应。着选择和阻碍，因此使凝胶本身又具有分子筛效应。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分

10、子量 聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续和不连续系统两种，聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续和不连续系统两种，不连续电泳系统是采用两种不同的缓冲液配制两种不连续电泳系统是采用两种不同的缓冲液配制两种不同浓度的凝胶，它可使样品在两层胶的界面处浓不同浓度的凝胶，它可使样品在两层胶的界面处浓缩，从而大达提高了电泳的分辨率，使之特别适用缩，从而大达提高了电泳的分辨率，使之特别适用于稀样品的分离。于稀样品的分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳法的特点：简便、快速、重复聚丙烯酰胺凝胶电泳法的特点：简便、快速、重复性好，只需几微克的样品即可进行测定。当分子量性好，只需几微克的样品即可进行测定。当分子量范围在范围在150002000

11、00D时，所测得的结果与用其它时，所测得的结果与用其它方法测得的结果相比，误差一般不超过方法测得的结果相比，误差一般不超过10%。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量1.2、材料与试剂、材料与试剂1、试验材料、试验材料 新鲜植物叶片（大蒜、菠菜、韭菜）新鲜植物叶片（大蒜、菠菜、韭菜）2、试验试剂、试验试剂SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 标准蛋白质标准蛋白质 名称名称 分子量（分子量（104D）-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 11.60牛血清白蛋白牛血清白蛋白 6.62鸡卵清蛋白鸡卵清蛋白 4.50 乳酸脱

12、氢酶乳酸脱氢酶 3.50核酸内切酶抑制剂核酸内切酶抑制剂 2.50-乳球蛋白乳球蛋白 1.84鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 1.44 其它试剂及使用时的注意事项参见其它试剂及使用时的注意事项参见P67。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量1.3、操作方法、操作方法1、凝胶的制备、凝胶的制备试剂名称试剂名称 12%分离胶分离胶 4%浓缩胶浓缩胶30.8%胶母液胶母液 3 ml 0.35mlTris-HCl(pH 8.9)0.9 ml Tris-HCl(pH 6.7)0.3 ml10%SDS 75 ul 25ulTEMED（原液）（原液）4 ul 5 ul

13、H2O 3.5 ml 2.3 ml10%过硫酸铵（过硫酸铵（AP）60 ul 25 ul SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量2、样品的提取及处理、样品的提取及处理、样品的提取、样品的提取 取新鲜叶片，冲洗干净，吸干表面水分，去掉叶脉，取新鲜叶片，冲洗干净，吸干表面水分，去掉叶脉，称取去脉叶片称取去脉叶片0.5g，加入，加入0.05mol/L pH7.8的磷酸缓的磷酸缓冲液冲液2ml，加石英砂少许研磨成匀浆，加石英砂少许研磨成匀浆，10000r/min离心离心10min，上清备用。，上清备用。、样品的处理、样品的处理 取取30ul待测样品的上清于离

14、心管中，加入待测样品的上清于离心管中，加入30ul浓样浓样品溶解液，混匀，置于品溶解液，混匀，置于100水浴中保温水浴中保温35min，取出冷却备用。取出冷却备用。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 若待测样品浓度太稀应事先浓缩；若样品盐浓度太若待测样品浓度太稀应事先浓缩；若样品盐浓度太高则需先行透析，再进行上述处理。高则需先行透析，再进行上述处理。其它操作步骤及注意事项解说详见其它操作步骤及注意事项解说详见P68。1.4、实验结果及处理、实验结果及处理 用直尺分别量出染料的迁移距离和各样品区带的迁用直尺分别量出染料的迁移距离和各样品区带的迁移距离，如图所示：移距离，如图所示：按下列公式计算相对迁移率按下列公式计算相对迁移率mR：0加加样样浓缩胶浓缩胶染染料料迁迁移移距距离离样样品品迁迁移移距距离离染染料料位位置置电电泳泳方方向向分离胶分离胶样品迁移距离（样品迁移距离（cm）染料迁移距离（染料迁移距离（cm）相对迁移率相对迁移率mR=SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，绘制标准曲线。并根据待测样品的相对迁移率，从绘制标准曲线。并根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。标准曲线上查出其分子量。