生物化学合工大第二章蛋白质化学1课件.ppt

1、第二章 蛋白质化学 氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位（构件分子）。从组成蛋白质的基本单位（构件分子）。从各种生物体内发现的氨基酸已有各种生物体内发现的氨基酸已有180多种，多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸只有但参与蛋白质组成的常见氨基酸只有20种，种，这这20种种氨基酸称为氨基酸称为常见氨基酸常见氨基酸或基本氨基或基本氨基酸。酸。amino acid,aa 或或 AA氨基酸的结构氨基酸的结构氨基酸的结构通式氨基酸的结构通式 H3NCHCOOR-+H2NCHCOOHR或或氨基酸是含有氨基的羧酸，不同氨基酸的氨基酸是含有氨基的羧酸，不同氨基酸的

2、R基不同，基不同，（除脯氨酸外）都为（除脯氨酸外）都为L-氨基酸。氨基酸。H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H据据R基团基团化学结构化学结构分类分类 脂肪族脂肪族A（16种）种）芳香族芳香族A(Phe、Tyr、Trp)杂环杂环(His、Pro)据据R基团基团极性极性分类分类极性极性R基团基团AA非极性非极性R基团基团AA不带电荷不带电荷带电荷带电荷带正电荷（种）带正电荷（种）带负电荷（种）带负电荷（种）据据酸碱性质酸碱性质分类分类中性（一氨基一羧基）中性（一氨基一羧基）酸性酸性 (一氨基二羧基一氨基二羧基 )GluGlu、AspAsp碱性碱性(

3、)()（二氨基一羧基）（二氨基一羧基）LysLys、HisHis、ArgArg据据营养营养学分类学分类 必需必需非必需非必需人的必需氨基酸人的必需氨基酸Met Trp Lys Val Ile Leu Phe ThrMet Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr假假 设设 来来 借借 一一 两两 本本 书书 ArgArg、His TrpHis Trp、CysCys甘氨酸甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸丙氨酸 （Ala,A）缬氨酸缬氨酸 （Val,V）亮氨酸亮氨酸 （Lue,L）异亮氨酸异亮氨酸 （Ile,I）1.侧链只是烃链（侧链只是烃链（5种）种）脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸2.侧链含

4、有羟基侧链含有羟基（2种）种）丝氨酸丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸苏氨酸 （Thr,T）3.侧链含硫原子（侧链含硫原子（2种）种）半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met,M）4.侧链含有羧基或酰胺基（侧链含有羧基或酰胺基（4种）种）天冬氨酸天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺谷氨酰胺 （Gln,Q）5.侧链含有碱性基团（侧链含有碱性基团（3种）种）赖氨酸赖氨酸 （Lys,K）精氨酸精氨酸（Arg,R）组氨酸组氨酸 （His,H）苯丙氨酸苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸色氨酸 （Trp,W）杂环氨基酸

5、组氨酸组氨酸（His,H）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）非非极极性性氨氨基基酸酸极极性性中中性性氨氨基基酸酸带正电荷的氨基酸带正电荷的氨基酸带负电荷的氨基酸带负电荷的氨基酸 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为常称为不常见蛋白质氨基酸不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是在蛋白。这些氨基酸都是在蛋白质合成后由相应的基本氨基酸衍生而来的。质合成后由相应的基本氨基酸衍生而来的。NHHOCOOH4-羟基脯氨酸H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOHNH25-羟基赖氨酸NH2CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH6-N-甲基赖氨酸HOIICH2

6、CHCOOHNH23,5-二碘酪氨酸 非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸：存在于生物体内，但不组成蛋白质存在于生物体内，但不组成蛋白质 的呈游离或结合态的氨基酸，约的呈游离或结合态的氨基酸，约150种，具有多种生种，具有多种生理功能。理功能。（1）L-氨基酸的衍生物氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸和瓜氨酸和L-鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。（2）D-氨基酸氨基酸 D-Ala存在于肽聚糖中，存在于肽聚糖中，D-Phe是短杆菌肽是短杆菌肽S的组分。的组分。（3）、-氨基酸氨基酸 -Ala是泛酸的前体，是泛酸的前体，-氨基丁酸是传递神经冲动的化氨基丁酸是传递神经冲动的化 学介质。学

7、介质。、氨基酸的构型、旋光性和光吸收氨基酸的构型、旋光性和光吸收 构型构型：组成蛋白质的氨基酸除：组成蛋白质的氨基酸除GlyGly以外都有手性碳原子，以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为这两种不同的构型分别称为D-D-型和型和L-L-型。型。以丙氨酸为例以丙氨酸为例：如含两个手性碳原子，则有种立体异构体，分别称为如含两个手性碳原子，则有种立体异构体，分别称为-,-,-，别，别-和别和别-氨基酸。氨基酸。H2NCHCOOHCCH3OHHHCNH2COOHCCH3OHHHCNH2COOHCC

8、H3HHOH2NCHCOOHCCH3HHO L-苏氨酸苏氨酸(L-threonine)D-苏氨酸苏氨酸(D-threonine)L-别别-苏氨酸苏氨酸(L-allo-threonine)D-别别-苏氨酸苏氨酸(D-allo-threonine)自然界中组成蛋白质的氨基酸都是自然界中组成蛋白质的氨基酸都是L-L-型。型。(Gly(Gly除外除外)旋光性：旋光性：组成蛋白质的氨基酸除组成蛋白质的氨基酸除GlyGly以外，都有手性碳原子，以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用转，向左旋转的称左旋，

9、用“一一”号表示，向右旋转的号表示，向右旋转的称右旋，用称右旋，用“”号表示。是号表示。是AAAA的物理常数，与结构、的物理常数，与结构、PHPH值有关。值有关。消旋消旋外消旋外消旋内消旋内消旋光吸收：光吸收：组成蛋白质的氨基酸中，组成蛋白质的氨基酸中，TrpTrp、TyrTyr和和 PhePhe对对紫外光紫外光有一定的吸收，这是因为有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都这三个氨基酸的光吸收都在在280nm280nm附近。附近。pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pH中性中性AA酸性酸性AA逐

10、步提高洗逐步提高洗脱液脱液pH和离和离子强度子强度 二、电泳二、电泳 氨基酸在氨基酸在pH高于或低于其高于或低于其pI的溶液中为带电的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过氨基酸在电场中泳动而达到分离各种氨基酸的技术氨基酸在电场中泳动而达到分离各种氨基酸的技术,称为称为电泳电泳(elctrophoresis)。分离氨基酸混合物常用分离氨基酸混合物常用纸电泳纸电泳。一、蛋白质的定义一、蛋白质的定义 蛋白质蛋白质(Protein，pr)：是一切生：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸物体中普遍存在的，由天然氨基酸按照一定的顺序，通过肽

11、键连接而按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大成的一条或多条肽链构成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。性状的一类主要物质。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16，这是凯氏定氮法这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据：测蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量蛋白质含蛋白质含量蛋白质含N量量6.25蛋白质的外形分类蛋白质的外形分类球状蛋白质球状蛋白质 外形接近球形或椭圆形，溶解性较好

12、，能形成结晶，大多外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。但肌动蛋白属于球状蛋白却不溶于水。数蛋白质属于这一类。但肌动蛋白属于球状蛋白却不溶于水。纤维状蛋白质纤维状蛋白质 分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和 不溶性纤维状蛋白质。不溶性纤维状蛋白质。不溶性纤维状蛋白质：大多数纤维状蛋白质属此类，如不溶性纤维状蛋白质：大多数纤维状蛋白质属此类，如 胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等。胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等。可溶性纤维状蛋白质：肌球蛋白和血纤蛋白原可溶于水。可溶性纤维状蛋白质：肌球蛋白和血

13、纤蛋白原可溶于水。多肽链条数分类多肽链条数分类单体蛋白质单体蛋白质 仅含一条多肽链。仅含一条多肽链。多聚蛋白质多聚蛋白质 含两条或多条多肽链。含两条或多条多肽链。例如：例如：牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶：一条多肽链：一条多肽链 胰岛素胰岛素：两条（两种）多肽链：两条（两种）多肽链 血红蛋白：四条（两种）多肽链血红蛋白：四条（两种）多肽链 胰岛素胰岛素牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶血红蛋白血红蛋白一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary st

14、ructure)高级高级结构结构蛋白质的一级结构决定高级结构！蛋白质的一级结构决定高级结构！肽是由肽是由一个氨基酸的一个氨基酸的-羧基羧基与与另一个氨基酸的另一个氨基酸的-氨基氨基脱水缩合而形成的无分支线形聚合物。其中的氨脱水缩合而形成的无分支线形聚合物。其中的氨基酸单位称基酸单位称氨基酸残基氨基酸残基。氨基酸间缩水形成的共价键称氨基酸间缩水形成的共价键称肽键肽键(peptide bond)。NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH-

15、CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸*两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成二肽二肽，三分子氨基酸缩合则形成，三分子氨基酸缩合则形成三肽三肽*由十个以内由十个以内氨基酸氨基酸相连而相连而成成的的肽肽称为称为寡肽寡肽(oligopeptide)，由更多由更多 的氨基酸相连形成的肽称的氨基酸相连形成的肽称多肽多肽(polypeptide)。*多肽链多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。成的一种结构。N 末端：多肽链中有自由氨基的一端末端：多肽链中有自由氨基的一端C 末端：多肽链中有自由羧基的一端

16、末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端多肽链有两端氨基酸的顺序是氨基酸的顺序是N 端端C 端的排列顺序。如上述五肽可表示为：端的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gly 丝氨酰酰缬氨酰酰酪氨酰酰天冬氨酰酰谷氨酸酸COOH氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽键中的键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。所键具有部分双键性质，不能自由旋转。所以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面称为称为肽平面肽平面。在大多数情况下，相邻肽平面以反式结。在大多数情况下，

17、相邻肽平面以反式结构存在。构存在。酰胺平面酰胺平面 由肽键周围的由肽键周围的6个原子组成的刚性平面个原子组成的刚性平面键长介于单键长介于单双键之间双键之间 +类似于氨基酸性质类似于氨基酸性质 双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物与碱与碱性硫酸铜作用，生成蓝紫色的复合物，肽键越多颜色性硫酸铜作用，生成蓝紫色的复合物，肽键越多颜色越深，受蛋白质特异性影响小，可用于肽和蛋白质定越深，受蛋白质特异性影响小，可用于肽和蛋白质定量测定及测定蛋白质水解程度。量测定及测定蛋白质水解程度。-GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还

18、原酶还原酶NADPH+H+NADP+谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，作用是保护巯基酶，或防止过氧化物原酶的辅因子，作用是保护巯基酶，或防止过氧化物积累。积累。抗生素类多肽抗生素类多肽短杆菌肽短杆菌肽S 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽激素类多肽激素类多肽、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primary structure)包括：包括：(1)组成蛋白质的组成蛋白质的多肽链数目多肽链数目;(2)多肽链的多肽链的氨基酸顺序氨基酸顺序;(3)多肽链内或链间多肽链内或链间二硫键的数目和位置二硫键的数目和位置。其中

19、最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础质生物功能的基础。2.蛋白质一级结构测定的意义蛋白质一级结构测定的意义是推测蛋白质高级结构的分子依据是推测蛋白质高级结构的分子依据是理解蛋白质生理功能的分子基础是理解蛋白质生理功能的分子基础是阐明遗传疾病发生机理的分子手段是阐明遗传疾病发生机理的分子手段是研究生物进化的分子佐证是研究生物进化的分子佐证 胰岛素胰岛素一级结构一级结构高级结构高级结构镰刀形镰刀形红细胞红细胞正常红正常红细胞细胞-链链N端氨基酸排列顺序端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）（正常人）Val-H

20、is-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患（患 者）者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys生物生物 与人不同的与人不同的AAAA数目数目黑猩猩黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、猪、羊、狗牛、猪、羊、狗 11马马 12鸡、火鸡鸡、火鸡 13响尾蛇响尾蛇 14海龟海龟 15金枪鱼金枪鱼 21角饺角饺 23小蝇小蝇 25蛾蛾 31小麦小麦 35粗早链孢霉粗早链孢霉 43酵母酵母 44 14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGly

21、ArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素血红素 细胞色素细胞色素c c分子的空间结构分子的空间结构不变不变的的AAAA残基残基 35个不变的个不变的AA残基，是残基，是Cyt C 的生物功能所不的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与可能参与电子传递；有的可能参与“识别识别”并结合并结合细胞色素还原酶和氧化酶。细胞色素还原酶和氧化酶。3.一级结构测定的原则和基

22、本流程一级结构测定的原则和基本流程一级结构测定的原则：一级结构测定的原则：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列完整序列。目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。蛋白质的一级结构。将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定拆开二硫键拆开二硫键纯蛋白质纯蛋白质通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸

23、序列通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列一级结构测定的基本流程一级结构测定的基本流程:（7）酰胺基位置的确定。）酰胺基位置的确定。测定蛋白质的一级结构前的测定蛋白质的一级结构前的准备工作准备工作A.样品纯度必须样品纯度必须97%以上；以上；聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带B.测定蛋白质的相对分子质量；测定蛋白质的相对分子质量；SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法，凝胶过滤法，沉降系数法C.测定蛋白质多肽链种类

24、和数目；测定蛋白质多肽链种类和数目；种类：种类：SDS-PAGE 数目：数目：N末端氨基酸残基摩尔数末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数蛋白质摩尔数D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数；个数；E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。4.蛋白质的一级结构测定蛋白质的一级结构测定1）多肽链的拆分）多肽链的拆分获得单条线形多肽链获得单条线形多肽链 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。如：血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体分。如：血红蛋白为四

25、聚体，烯醇化酶为二聚体等。等。拆分非共价键：可用拆分非共价键：可用8mol/L尿素尿素或或6mol/L盐酸胍处理。盐酸胍处理。拆分拆分拆分拆分巯基的保护-OOCCHCH2SHNH3+ICH2CNH2OCH2OCClOCH2Cl-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2-OOCCHCH2SNH3+CH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+2）N-末端和末端和C-末端氨基酸残基的确定末端氨基酸残基的确定为氨基为氨基 酸序列排列建立两个重要的参考点酸序列排列建立两个重要的参考点N端分析方法：端分析方法：二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNPDNP法、法、DNFBDNFB法或法或FDNBFDNB法）

26、法）丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNSDNS法）法）丹磺酰丹磺酰-氨氨基酸有很强基酸有很强的荧光性质的荧光性质 苯异硫氰酸苯异硫氰酸(酯酯)法（法（PITCPITC法、法、PTCPTC法、法、PTHPTH法、法、EdmanEdman降解法降解法 ）由于其连续反应特性，由于其连续反应特性，成为蛋白质序列分析仪成为蛋白质序列分析仪的分析原理！的分析原理！氨肽酶（氨肽酶（aminopeptidase,Apaseaminopeptidase,Apase）法）法 AlaValGly氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的端逐个的水解。根据不

27、同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的量，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。C末端分析方法末端分析方法肼解法：肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与与苯甲醛缩合成不溶于水

28、的物质而与C-C-端氨基酸分离端氨基酸分离。羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的链的C-端逐个的水解。端逐个的水解。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和和Y。羧肽酶。羧肽酶A能能水解除水解除Pro,Arg和和Lys以外的所有以外的所有C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B只能水解只能水解Arg和和Lys为为C-末端残基的肽键。末端残基的肽键。（3）多肽链部分裂解成较小的片段）多肽链部分裂解成较小的片段化大为小，化大为小，获得短肽段获得短肽段甲硫氨酸甲硫氨酸胰蛋白酶：胰蛋白酶：R1=R1=赖氨酸赖氨酸LysLys和精

29、氨酸和精氨酸ArgArg侧链侧链（专一性较强（专一性较强，水解速度快）。，水解速度快）。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1糜蛋白酶糜蛋白酶胃蛋白酶：胃蛋白酶：在疏水性氨基酸处部分水解，最在疏水性氨基酸处部分水解，最适反应适反应pH为为23。（4）测定各短肽段的氨基酸序列）测定各短肽段的氨基酸序列利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。对角线电泳动态图解对角线电泳动态图解 （7）酰胺基位置的确定）酰胺基位置的确定AspAsn、GluGln方法：酶解肽链，产生含有单个方法：酶解肽链，产生含有单个Asx或或Glx的肽，用的肽，用电泳法确定是电泳法确定是Asp还是还是Asn。