生物制药动物细胞工程课件.ppt

1、动物细胞工程制药张忠山第八章第八章 动物细胞制药实例动物细胞制药实例 1、组织纤溶酶原激活剂（、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺）生产工艺 2、促红细胞生成素（、促红细胞生成素（EPO）生产工艺）生产工艺1、组织纤溶酶原激活剂（、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺）生产工艺 组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，它可使组织纤溶酶原活化成纤溶酶，而纤溶酶可水解纤维蛋白，因此组织纤溶酶原激活剂对血栓具有治疗作用。培养基-Eagle培养基，加入青霉素100U/ml、链霉素100U/ml、10%小牛血清。当体内形成血栓时，血液中的纤溶酶原（pg）因对纤维蛋白（fn）具有相当的亲和性而部分富集

2、于血栓周围，纤溶酶原激活剂（pA）能将pg激活为纤溶酶（pm），具有丝氨酸蛋白酶活性的pm则能降解构成血栓骨架的fn，从而起到溶栓作用。基础Eagle培养（Basal Medium Eagle），1955年由Eagle设计，BSS12种氨基酸谷氨酰胺8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM等。（1）t-PA抗体的制备（2）抗t-PA的亲和吸附剂的制备 A、Sepharose 4B的活化 B、抗t-PA亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备（3）细胞培养（4）t-PA的分离（5）t-P

3、A的精制（1）t-PA抗体的制备抗体的制备取人t-PA、或者猪心t-PA按每只家兔200-300ug的计量，t-PA采用福氏完全佐剂充分乳化，注射入家兔皮下。每隔2周再用t-PA100ug进行加强免疫，共加强2次取家兔血清用50%硫酸铵盐析沉淀物于0下，用生理盐水透析经过Sephadex 75柱层析得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG备用（2）抗）抗t-PA的亲和吸附剂的制备的亲和吸附剂的制备A、Sepharose 4B的活化B、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备A、Sepharose 4B的活化的活化Sepharose 4B用10倍体积的蒸馏水（

4、V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽滤取20克Sepharose 4B湿凝胶放入500ml的三颈烧瓶中，加蒸馏水30ml，搅均匀后，用2mol/L的NaOH溶液调节PH=11，降温至18在通风橱中，另取溴化氰1.5g于乳钵中，加入30-40ml蒸馏水分多次研磨溶解将溴化氰溶液倒入三颈烧瓶中，升温至20-22，同时滴加2mol/L的NaOH溶液调节PH=11-12等反应液PH值不变时，继续反应5分钟，取出烧瓶，向其中投入小冰块降温，用3号垂熔漏斗抽滤用300ml、4、0.1mol/L的NaHCO3溶液洗涤。然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸缓冲液分3-4次抽滤洗涤最后转移至25

5、0ml的烧瓶中，加入50-60ml的硼酸缓冲液，即得活化的Sepharose 4B，备用B、抗、抗t-PA的亲和吸附剂（的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4Bt-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附亲和吸附剂剂）的制备）的制备取步骤-2中的抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸缓冲液中、过滤。滤液加入到已经活化的Sepharose 4B中，10下搅拌反应16-18小时第二天装柱，用10倍柱床体积（V/V）、PH=10.2的硼酸缓冲液，以5-6ml/min的流速洗涤柱床。收集流出液，测定其A280用5倍柱床体积（V/V）的、PH=10.0、0.1

6、mol/L乙醇胺溶液洗涤柱床用5倍柱床体积（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤柱床用5倍柱床体积（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡。直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的亲和吸附剂。将其转移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液中，于4下贮存，备用。（3）细胞培养）细胞培养取5L玻璃转瓶，按每平方米表面积2.5L的比例加入细胞培养液。将人黑色素瘤细胞按常规方法消化分散、洗涤、计数、稀释成细胞悬液。将细胞悬浮液接种到转瓶之中，接种浓度为1033*103个/

7、ml置于CO2培养箱中，37下培养、通入含5%CO2的无菌空气等到长成致密单层之后，弃去培养液，用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤细胞单层2-3次。换入无血清Eagle培养液继续培养每隔3-4天收获一次培养液，用于制备t-PA。同时向转瓶中加入新鲜培养液继续培养如此反复，可获得大量t-PA。（4）t-PA的分离的分离步骤-4中所收集到的培养液中，加入蛋白酶抑制剂aprotinin至5万单位/ml。加吐温-80至于0.01%、过滤、除去沉淀.滤液稀释3倍稀释液上柱，以5ml/min的流速进入t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和柱（直径4cm*长度40cm）。用含0.01%

8、的吐温-80+2.5万单位/ml的蛋白酶抑制剂aprotinin+0.25mol/L的KSCN的PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液以同样的流速洗涤亲和柱，以除去杂蛋白最后用3mol/L的KSCN溶液洗脱亲和柱，以每管10-15ml的体积进行分区收集合并t-PA的洗脱峰，装入透析袋内，埋入到PEG20000中浓缩至原体积的1/10-1/5。各t-PA粗提物（5）t-PA的精制的精制 t-PA粗提物进Sephadex-G-150柱（直径2cm*长度100cm）用含0.01%的吐温-80的1mol/L的NH4HCO3溶液以2-3ml/min的流速进行洗脱以每管10-15ml的体积进行分区收集

9、合并t-PA的洗脱峰，于冻干机中进行冻干得t-PA精品2、促红细胞生成素（、促红细胞生成素（EPO）生产工艺）生产工艺 EPO首先是从严重再生障碍性贫血病人的尿中分离得到。天然的EPO是一种高度糖基化的糖蛋白，有165年氨基酸残基，其分子量约为3436kDa，以质量计，糖链的分子量3940%。红细胞生长素（Erythroprotein，EPO）是合成红细胞的主要刺激因子，也是调节和维持血液循环中红细胞生理水平的主要激素。EPO主要由成年人的肾脏和胎儿的肝脏产生。当肾脏遭受进行性操作时，如慢性肾衰竭，就会因减少EPO的产生引起贫血。EPO主要用于由多种疾病引起的严重贫血各种生产方法的比较各种生产

10、方法的比较 （1）由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得人源的红细胞生成素。但其产量极其有限。（2）昆虫SF9细胞中杆状病毒系统表达rhEPO。产率有所改善，但糖基化程度较小。（3）大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。（4）家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。（5）在CHO、BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产动物细胞培养法表达EPO工艺简介 1、目的基因的获得：主要有两种方式获得编码EPO的DNA片段：a.提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡聚核苷酸为引物，经

11、PCR反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后进行体外拼接；b.另一种是提取人胎肝mRNA，经过逆转录合成cDNA文库。或者筛选人胎肝基因组文库，得到编码人红细胞生成素的基因，切下人红细胞生成素基因与表达载体相连接，导入哺乳动物细胞，提取mRNA，再逆转录成cDNA文库。筛选cDNA文库，得到编码人红细胞生成素的DNA片段。2、编码EPO的DNA片段与表达载体相连接 常用的表达载体有pDSVL、pSV2，这两种质粒带有二氢叶酸还原酶（dhfr）。3、细胞株的构建：将重组质粒导入哺乳动物细胞，经筛选得到所需要的细胞株。常用的宿主细胞为COS细胞（COS细胞系，是用克隆在大肠杆菌质粒载体上其复制起

12、点失活的 SV40早期区段DNA，转化正常的猿猴受纳细胞CV-1而得到的。故特称为COS（CV-l，origin,SV40）细胞系及CHO细胞。4、种子细胞制备（1）冻存的细胞株37水浴，无菌离心。（2）加适量DMEM培养基（10%小牛血清）。（3）37、CO2培养箱培养，连续传三代。（4）细胞消化后接种，制成接种细胞浓度。5、灌流培养 （1）反应器灭菌：加纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，高压灭菌1.5h；（2）接种：排出PBS缓冲液，加DMEM培养基，接种；（3）贴壁培养：pH7，50r/min，37，DO 50-80%；（4）扩增培养：80100 r/min。（5）灌流培养：控制温

13、度、DO、pH值等培养条件，进行无血清培养基连续培养。（6）收获培养物，48保存。6、培养工艺过程控制 （1）搅拌控制：接种后，搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。（2）温度控制：较为严格，恒定37；（3）pH值控制：7.2-7.4，输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定；（4）溶解氧控制：在50-80的范围内，通入氧气、空气或氮气的比例混合气体；（5）葡萄糖控制：流加补料；（6）代谢废物控制：测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度，减少对细胞损害。7、初分 收获培养液：离心。过滤：滤膜。亲和色谱：NaClTris平衡，梯度洗脱，收集活性洗脱峰。透析：0.1mM Tris

14、，过夜，换液4次。过滤：0.22 m滤膜。纯化精制 8、纯化精制 DEAE离子交换：NaCl-Tris梯度洗脱，收集活性峰。RP-HPLC：乙腈梯度洗脱，收集活性洗脱峰。凝胶过滤：柠檬酸盐缓冲液洗脱，收集活性峰 过滤：0.22m滤膜。rhEPO产品：蛋白含量为1.2 mg/ml，其比活可为2105 IU/mg。第九章 动物细胞工程制药前景与展望 1、改进表达载体，提高表达水平和产量 2、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 3、抑制细胞凋亡，延长培养周期 4、采用糖基化工程，提高产品质量 5、转基因动物的研究 6、组织工程的研究前三章复习题前三章复习题 一、名词解释 1、生物技术制药 2、

15、生物技术药物 3、基因工程技术 4、基因表达 5、透析培养 6、接触抑制 7、动物细胞融合 二、填空题 1、生物技术制药主要特征有:_、_、_、_、_。2、生物药物按功能用途可分为三类：_、_、_。3、基因工程生产的药物主要有：_、_、_、_。4、基因工程制药中获得目的基因的方法主要有:_、_、_。5、质粒不稳定的原因有：_、_。6、基因工程菌的培养方式有：_、_、_、_。7、基因表达的微生物宿主细胞中常用的原核细胞有：_、_、_；真核细胞有_、_。8、真核基因在大肠杆菌中表达的形式_、_、_。9、PCR扩增技术分四个步骤_、_、_、_。10、热原限度检验方法主要有_、_、_。11、动物细胞形

16、态主要分_、_、_。12、生产用动物细胞主要有_、_、_、_、_。13、将DNA导入动物细胞方法有_、_、_、_。14、细胞培养器材的清洗经_、_、_、_四个步骤。15、细胞计数方法主要有_、_、_、_。16、进行动物细胞培养的材料主要有_、_、_。17、动物细胞的大规模培养主要可分为_、_、_。18、动物细胞融合方法主要有_、_、_。19、动物细胞培养基的种类分_、_、_。三、简答题1、分析目前我国生物技术制药的研究对策。2、阐述基因工程药物研制的主要过程。3、比较三类主要基因工程表达体系。4、简答提高质粒稳定性的方法。5、简述动物细胞制药的新进展。四、论述题试论述基因工程宿主细胞应满足的条件。