植物生物技术第一章植物组织培养实验室的构建与无菌操作技术课件.ppt

1、本章主要内容本章主要内容第一章第一章第一章第一章一、植物组织培养实验室设计一、植物组织培养实验室设计二、仪器和设备二、仪器和设备三、玻璃器皿和用具三、玻璃器皿和用具第一节第一节 植物组织培养室建设植物组织培养室建设第一章第一章植物组织培养实验室设计植物组织培养实验室设计组织培养实验室主要包括：组织培养实验室主要包括：1.准备室准备室2.无菌操作室（接种室）无菌操作室（接种室）3.培养室培养室4.温室温室第一节第一节第一节第一节第一节第一节l是开展组织培养研究包括接种、继代、细胞融合等的场所。是开展组织培养研究包括接种、继代、细胞融合等的场所。第一节第一节第一节第一节2、高压蒸汽消毒锅、高压蒸汽

2、消毒锅第一节第一节3、超净工作台、超净工作台第一节第一节第一节第一节25（二）药品贮存、配制相关仪器设备（二）药品贮存、配制相关仪器设备超低温冰箱超低温冰箱第一节第一节2、天平、天平第一节第一节3、酸度计、酸度计PHS-802中文台式酸度计中文台式酸度计第一节第一节第一节第一节第一节第一节（三）培养设备（三）培养设备第一节第一节第一节第一节第一节第一节（四）观察分析仪器设备（四）观察分析仪器设备l倒置显微镜倒置显微镜 原生质体观察原生质体观察l普通显微镜普通显微镜 染色体和叶片气孔观察染色体和叶片气孔观察l荧光显微镜荧光显微镜 细胞活力观察细胞活力观察l体视显微镜体视显微镜 形态分化的实体观察

3、形态分化的实体观察l激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜l扫描电镜扫描电镜 病毒检测、细胞器变化病毒检测、细胞器变化l透射电镜透射电镜第一节第一节倒置显微镜倒置显微镜主要用于活体的观察比如原生质体培养的过程原生质体融合的动态过程等第一节第一节正置显微镜正置显微镜第一节第一节相差相差:一般在显微镜镜头上配置相差环；一般在显微镜镜头上配置相差环；该方法不要求标本染色，用于观察活体该方法不要求标本染色，用于观察活体细胞和微生物最为理想。细胞和微生物最为理想。荧光荧光：一般在显微镜镜体上配置荧光一般在显微镜镜体上配置荧光滤片，进行荧光蛋白质或荧光染色的观滤片，进行荧光蛋白质或荧光染色的观察察第一节第一节霍

4、夫曼调制相衬霍夫曼调制相衬(HMC)使透明的活体标本产生生动、具有三维立体感的图像。HMC成像技术中，标本可以置于塑料培养皿中观察。微分干涉相衬（微分干涉相衬（DIC）未经染色的活体细胞和微生物所观察到的图像具有三维浮雕状的立体感，且对比度和灵敏度出众。第一节第一节体视显微镜（解剖镜）体视显微镜（解剖镜）第一节第一节立体标本或材料的观察激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜Confocal microscopy第一节第一节绿色荧光蛋白标记目的基因在转基因烟草叶片细胞中的表达扫描电镜扫描电镜第一节第一节ABDCEF棉花纤维细棉花纤维细胞的突起及胞的突起及伸长伸长观察动植物、微生物细胞内的超微结观察动植

5、物、微生物细胞内的超微结构，如细胞膜、核膜、线粒体、内质构，如细胞膜、核膜、线粒体、内质网、高尔基体、核糖体等网、高尔基体、核糖体等透射电镜透射电镜第一节第一节体细胞胚与合子胚超微结体细胞胚与合子胚超微结构的观察构的观察第一节第一节第一节第一节（二）（二）.器械类器械类第一节第一节本节完第二节第二节 培养基配制培养基配制第一章第一章第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节2 2，4-D+KT4-D+KTIBA+KTIBA+KT第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节第二节2.硝酸钾含量较高

6、的培养基硝酸钾含量较高的培养基第二节第二节3.中等无机盐含量的培养基中等无机盐含量的培养基第二节第二节4.低无机盐含量培养基低无机盐含量培养基第二节第二节（二）基本培养基的选择（二）基本培养基的选择第二节第二节注意！注意！实际应用中要通过试验筛选。实际应用中要通过试验筛选。第二节第二节第二节第二节2.植物生长调节剂（植物生长调节剂（1000倍）倍）第二节第二节第二节第二节（二）培养基的配制步骤（二）培养基的配制步骤取一干净烧杯，加入取一干净烧杯，加入1/3体积的蒸馏水，用移液管量取所需量的母液加入烧杯体积的蒸馏水，用移液管量取所需量的母液加入烧杯称取定量琼脂加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全

7、溶解，分装称取定量琼脂加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装称取定量的糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容称取定量的糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容用用NaOH或稀或稀HCl调节调节pH值值高压灭菌，（高压灭菌，（121，15 min20min）冷却，取出，备用冷却，取出，备用第二节第二节本节完第一章第一章第三节第三节第三节第三节物理灭菌物理灭菌化学灭菌化学灭菌高温高压灭菌高温高压灭菌干热灭菌干热灭菌射线照射灭菌射线照射灭菌过滤灭菌过滤灭菌熏蒸灭菌熏蒸灭菌消毒液灭菌消毒液灭菌（二）（二）.灭灭菌方法菌方法第三节第三节（三）（三）灭菌原理灭菌原理1.1.高温高压灭菌高温高

8、压灭菌 原理：将待灭菌的物品放在一个密封的高压高温灭菌锅内，在原理：将待灭菌的物品放在一个密封的高压高温灭菌锅内，在121121高高温温和每平方厘米和每平方厘米1 1个大气压下，一般持续个大气压下，一般持续151530 min30 min，就可杀死一切微，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子，适于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。生物的营养体及其孢子，适于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。第三节第三节第三节第三节第三节第三节不能高温高压灭菌的物质：不能高温高压灭菌的物质：多糖多糖Colchicine（秋水仙素）（秋水仙素）Zeatin（玉米素）（玉米素）GA3（95%失活）失活）VB12、Vc、泛酸、泛

9、酸Antibiotics（抗生素）（抗生素）Plant extractsEnzymes第三节第三节第三节第三节第三节第三节一些表面消毒剂的使用方法一些表面消毒剂的使用方法消毒剂消毒剂 使用浓度使用浓度 消毒时间（消毒时间（min）次氯酸钙次氯酸钙 9-10%5-30次氯酸钠次氯酸钠 2%3-40过氧化氢过氧化氢 10-12%5-15溴水溴水 1-2%2-10硝酸银硝酸银 1%3-30氯化汞氯化汞 0.1-1%2-15抗生素抗生素 4-500mg/L 30-60第三节第三节第三节第三节第三节第三节(二二)、无菌操作、无菌操作植物组织培养是一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切植物组织培养是

10、一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要避免带菌，而用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要避免带菌，而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作的规程且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作的规程在进行无菌操作是要严守以下几点：在进行无菌操作是要严守以下几点：第三节第三节第三节第三节第三节第三节关灯（关灯（10 min）酒精消毒酒精消毒点燃酒精灯开始操作点燃酒精灯开始操作无菌操作步骤紫外灯灭菌（紫外灯灭菌（10 min）第三节第三节四、无菌培养四、无菌培养材料接种后应移入培养室培养，一般培养室要求整洁干净，有理想的光照材料接种后应移入培养室培养，一般培养室要求整洁干净，有理想的光照控温系统，控温系统，一般材料要求一般材料要求25-2825-28左右左右，晚上一般不应低于，晚上一般不应低于2020。第三节第三节