流式细胞基本原理和在白血病中应用课件.ppt
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- 细胞 基本原理 白血病 应用 课件
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1、流式细胞学在血液病流式细胞学在血液病中的临床中的临床应应用(基础篇)用(基础篇)吴雨洁吴雨洁江苏省人民医院江苏省人民医院2014.10.292014.10.29网络课堂网络课堂 流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念=流式细胞术流式细胞术是一项集激光技术、流体力学技术、光电测是一项集激光技术、流体力学技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技技术。技术为一体的新型高科技技术。=快速、准确、客观,多参数,可同时对特定群体快速、准确、客观,多参数,可同时对特定群体加以分选。加以分选。=研究对象为生物颗粒,
2、如各种细胞、微生物及人研究对象为生物颗粒,如各种细胞、微生物及人工合成微球等。工合成微球等。=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征,并研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征,并加以定量。加以定量。是当代最先进的细胞定量分析技术是当代最先进的细胞定量分析技术=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=微量残留白血病细胞检查微量残留白血病细胞检查=阵发性睡眠性血红蛋白尿阵发性睡眠性血红蛋白尿=多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤=干细胞计数干细胞计数=肿瘤细胞的周期和倍体分析肿瘤细胞的周期和倍体分析=网织红细胞和网织血小板计数网织红细胞和网织血小板计数=免疫状态监测免疫状态监测=血小板功能及相关疾病
3、血小板功能及相关疾病=HLA-B27HLA-B27流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用标本来源:标本来源:外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他血清或各类体液样本。血清或各类体液样本。肝素肝素抗凝的外周血和骨髓标本,存放时限为抗凝的外周血和骨髓标本,存放时限为4872小时;小时;EDTA抗凝标本,存放时限只有抗凝标本,存放时限只有12 24小时,因为髓细胞小时,因为髓细胞在此条件下会裂解;在此条件下会裂解;直方图直方图 散点图散点图二维等高图二维等高图密度图密度图常见的几种流式细胞图常见的几种流式细胞图 设设 门门02004006008
4、001000Side Scatter淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群一:白血病免疫分型白血病诊断依赖于多种检测方法白血病诊断依赖于多种检测方法样本形态学流式细胞术细胞遗传学/FISH分子生物学 基础和金标准 必需 重要急性白血病免疫分型的价值急性白血病免疫分型的价值 区分淋系、髓系白血病 区分淋系白血病中的T、B-ALL 鉴定混合细胞性白血病的类型:T-M、B-M、T-B、T-B-M 治疗过程中监测MRD,评价疗效 提示某些遗传学异常:CD19+AML-t(8;21);CD13+CD33+B-ALL-t(9;22)提示预后:CD56等阳性的AML患者预后不良 CD15阳性的AML患者CR率高正常造血细
5、胞各系列抗原表达的演进正常造血细胞各系列抗原表达的演进不不 管管 是是 在在 胚胚 胎胎 期期 、老、老 年年 期期 、还、还 是是 化化 疗疗 以以 后,正后,正 常常 造造 血血 细细 胞胞 抗抗 原原 组组 合合 的的 表表 达达 模模 式式 都都 不不 改改 变。变。造血细胞抗原组合的表达模型能够用于鉴别恶性克隆造血细胞抗原组合的表达模型能够用于鉴别恶性克隆!白血病克隆与正常细胞之白血病克隆与正常细胞之间抗原表达不同间抗原表达不同-白血病白血病相关相关的的免疫表型免疫表型(LAIP)免疫分型常用的抗体 干祖细胞 CD34、TDT、CD117、CD38、HLA-DR、AML CD33、C
6、D13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO怀疑M6加做CD71、GPA怀疑M7加做CD61、CD41、CD42 B-ALL CD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79a T-ALLCD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD1a、cCD3 NK细胞CD16、CD56、CD57 浆细胞CD38、CD138、c、c、CD19、CD56根据骨髓细胞根据骨髓细胞CD45/SSC CD45/SSC 图中分布情况图中分布情况设门圈定各类细胞设门圈定各类细胞R1 R1 门为成熟淋巴细胞门为成熟淋巴细胞R2 R2 门为正常单核细胞位置门为正常单核细
7、胞位置R3 R3 门正常粒细胞位置门正常粒细胞位置R4 R4 门为幼稚淋巴细胞出现位置门为幼稚淋巴细胞出现位置R5 R5 门为有核红细胞或细胞碎片位置门为有核红细胞或细胞碎片位置R6 R6 门为幼稚髓细胞出现位置门为幼稚髓细胞出现位置白血病细胞通常会在白血病细胞通常会在R4 R6 R4 R6 两门位置两门位置处出现处出现正常成人骨髓样本正常成人骨髓样本-CD45-CD45设门设门100101102103104CD45 PerCPAML-M1AML-M2AML-M3结论:结论:ANLL,ANLL,建议结合染色体和分子生物学和形态学诊断建议结合染色体和分子生物学和形态学诊断M3M3。R1R2 结论
8、:结论:ANLLANLL,伴单核细胞分化,免疫表型符合,伴单核细胞分化,免疫表型符合M4M4。100101102103104CD45 PerCP100101102103104CD45 PerCP结论:结论:ANLLANLL,伴单核细胞分化,免疫表型符合,伴单核细胞分化,免疫表型符合M5M5。结论:结论:ANLLANLL,建议结合形态学以确诊,建议结合形态学以确诊M6M6。R1R2R3R4AML-M7100101102103104CD45 PerCPB-ALLT-ALL 100101102103104CD45 PerCPEGIL Scoring System For BAL(2points)Sc
9、oreB-lymphoidT-lymphoidMyeloid2CD79aCD3MPOcCD22Anti-TCRa/bAnti-TCRg/d1CD19CD2CD117CD20CD5CD13CD10CD8CD33CD10CD650.5TdTTdTCD14CD7/1aCD15/64Requirements for assigning more than one lineage to a single blast population Myeloid lineage Myeloperoxidase(flow cytometry,immunohistochemistry or cytochemistry
10、)or Monocytic differentiation(at least 2 of the following:NSE,CD11c,CD14,CD64,)T lineage Cytoplasmic CD3(flow cytometry with antibodies to CD3 epsilon chain;immunohistochemistry using polyclonal anti-CD3 antibody zeta chain,which is not T-cell specific)or Surface CD3(rare in mixed phenotype acute le
11、ukemia)B lineage Strong CD19 with at least 1 of the following strongly expressed:CD79a,cytoplasmic CD22,CD10 or Weak CD19 with at least 2 of the following strongly expressed:CD79a,cytoplasmic CD22,CD10MPAL(mixed phenotype acute leukemia)WHO 2008CD19+CD22+CD10-CD15+(B-lineage ALL)B-negative,CD64+CD14
12、+/-CD33+(MonocyticLeukemia)Two Leukemic PopulationsMonoblastsLymphoblasts结论:急性混合细胞白结论:急性混合细胞白血病血病(AM-LL)(AM-LL)二二.白血病微小残留病灶白血病微小残留病灶(MRDMRD)目的:目的:判断预后,指导个体化分层治疗,预测复发B-ALL:多数表达CD34、CD38dim、TDT、CD19、CD10str、CD20,这些标志的任意组合CD34/CD22、CD34/CD20、TDT/CD10等,也可加上某些异常标志如 CD13、CD33、CD15即可将ALL细胞与正常骨髓和外周血细胞分开(608
13、0%)。T-ALL:TDT结合T细胞表面标志如CD5或CD3,加上cCD3(90%).AML:CD34、CD56、CD15在内的多种组合,表达TDT、CD13、CD33与散射光及抗原密度,可确定残留的AML细胞(7080%)LEUKEMIA LEUKEMIA AT DIAGNOSISAT DIAGNOSISNORMALNORMALDAY290.039%100101102103104CD45 PerCP100101102103104CD45 PerCP2013.4.21,原始细胞占79.2%2013.5.18,MRD:1.09%CD19/CD33/CD10/CD20 三三.成熟淋巴细胞增殖成熟淋
14、巴细胞增殖性疾病性疾病v慢性淋巴细胞白血病慢性淋巴细胞白血病v幼稚淋巴细胞白血病幼稚淋巴细胞白血病v毛细胞白血病毛细胞白血病v脾边缘区淋巴瘤脾边缘区淋巴瘤v大颗粒淋巴细胞白血病大颗粒淋巴细胞白血病v皮肤皮肤T T细胞淋巴瘤相关白血病细胞淋巴瘤相关白血病 循环淋巴细胞增殖性疾病循环淋巴细胞增殖性疾病这类疾病必须有流式细胞术的辅助诊断!这类疾病必须有流式细胞术的辅助诊断!正常淋巴细胞淋巴细胞增殖性疾病(克隆扩增)TB NKor or 确定克隆来源!确定克隆来源!lB-LPD:B淋巴细胞出现轻链的单一抑制性表达;lT/NK-CLPD:由于缺乏单克隆的标记物,通过FCM诊断成为难点。正常正常单克隆单克
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