流式细胞仪的原理及应用课件.ppt
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- 关 键 词:
- 细胞 原理 应用 课件
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1、 流式细胞仪原理流式细胞仪原理 及其应用及其应用 流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理 流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念=流式细胞术(Flow Cytometry,简称FCM)是一种可以快速、准确、客观,并且同时检测单个微粒(通常是细胞)的多项特性,并加以定量的技术,同时可以对特定群体加以分选;研究对象多为生物颗粒,如各种细胞、微生物及人工合成微球等;研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征,并加以定量。流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念 CD:是cluster of differentiation 的缩写,指的是分化群或分化簇,即将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原归为一
2、个分化群,每一CD分子代表一种或一类分化抗原。Antibody:抗体是能与抗原特异性结合并具有免疫活性的球蛋白。它一般是由抗原刺激B细胞分化成浆细胞后产生的。抗体分子具有结合部位(结合簇),能与对应的抗原决定簇结合。抗体与不同的抗原结合往往出现不同的反应,因而常给抗体以不同的名称,如凝集素、沉淀素、抗毒素、溶血素、溶菌素等。流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念 Fluorescein:荧光素,是指在一定波长的电磁波(常为蓝光或紫外光)照射下能发出荧光的一类染料;常见的荧光素有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、藻红蛋白(R-Phycoeryth
3、rin,R-PE)、别藻青蛋白(allophycocyanin,APC)、多甲藻叶绿素蛋白(peridinin chlorophyll protein,PerCP)等。流式细胞术的特点流式细胞术的特点v 极短时间内可分析大量细胞,只要标本中的细胞数量足够,流式细胞仪(Flow cytometer)可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量,测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。v 可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数更为准确。v 定性或定量分析细胞:通过
4、荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析 v 强大的分选功能,在分析的同时可以对特定群体加以分选流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小=细胞粒度=细胞表面面积=核浆比例=DNA含量与细胞周期=RNA含量=蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面/胞浆/核的特异性抗原=细胞活性=细胞内细胞因子=酶活性=激素结合位点=细胞受体当前流式细胞分析发展趋势当前流式细胞分析发展趋势v从相对细胞计数到绝对细胞计数 v从相对定量到绝对定量分析v从单色到多色荧光分析 v从细胞膜成分到细胞内成分分析v从
5、细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析 光学系统 鞘流系统 电子系统 计算机系统 数据转换处理系统流式细胞仪的组成光学系统:光学系统:激发光源:弧光灯和激光两大类激发光源:弧光灯和激光两大类 激光优点:稳定性好、能量高、发散角小;激光分类:气体激光器、染料激光器、半导体激光器 气体激光器:氩离子激光(488nm)氪离子激光(647nm)氦-氖激光(633nm)FACSCaliburTM 采用了氩离子激光(488nm)和波长为635nm的半导体激光器。光信号检测光信号检测 散射光信号散射光信号Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward L
6、ight Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source=前向角散射光(前向角散射光(FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter)细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光(侧向角散射光(SSC,Side ScatterSSC,Side Scatter)细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性LaserFALS Sensor光信号检测光信号检测荧光信号荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色,做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色,做多色分析荧光信号的强弱,反映了细胞抗原的表达含
7、量荧光信号的强弱,反映了细胞抗原的表达含量光信号检测光信号检测常见荧光染料的发射波长光信号收集 分光镜 滤光镜:长通(LP)短通(SP)带通(BP)光电信号转换:光电倍增管(PMT)光电二极管荧光补偿原理荧光补偿原理 颜色补偿:采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时,都需要作颜色补偿。带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光,故会有干扰光同时被接收,然后一同进入PMT进行光电转换并放大。通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%补偿模型图补偿模型图鞘流系统鞘流系统 流动室Injector Tip荧光信号聚焦的激光光束鞘液鞘液鞘流原理 鞘流公式 Re=dv Re为雷
8、诺(Reynolds)系数,d 为管道直径,v 为液体流速,密度为,黏滞系数为。当Re单核细胞单核细胞成熟粒细胞成熟粒细胞原幼细胞,原幼细胞,在红细胞中不表达;在红细胞中不表达;SSC是侧向角参数,反应细胞的颗粒度是侧向角参数,反应细胞的颗粒度(成熟粒细胞(成熟粒细胞单核细胞单核细胞原幼细胞原幼细胞淋巴细胞)淋巴细胞)。目前,国际上采用CD45SSC设门(设门(Gating),可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开,增加白血病免疫分型的准确性。CD45的临床应用的临床应用 用用CD45-SSC设门寻找异常细胞,将细胞分为设门寻找异常细胞,将细胞分为5个群个群体体,当幼稚细胞达70-80%时,即
9、可大致估计AL的类型。骨髓成分复杂,各种大小和分化程度的细胞均有,若不用CD45-SSC设门,我们检测到的阳性细胞的百分率是以总细胞为分母来计算,当时以阳性细胞大于20%为界线,现在以CD45-SSC设门,排除了正常细胞的干扰,阳性细胞的百分率是以幼稚细胞为分母,因此再以阳性细胞20%作界线则不太合适了,所以,用CD45-SSC设门寻找异常细胞时,以定性比定量更重要。正常人血液白细胞免疫表型散点图正常人血液白细胞免疫表型散点图正常人血液细胞免疫表型正常人血液细胞免疫表型 T淋巴细胞:淋巴细胞:CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+,部分细胞,部分细胞CD(16+
10、56)+,无,无CD4+CD8+双双阳性细胞阳性细胞 B淋巴细胞:淋巴细胞:CD45+、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK细胞:细胞:CD45+、CD(16+56)+/CD3-单核细胞:单核细胞:CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中性粒细胞:中性粒细胞:CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+,CD13比比CD33表达更高表达更高 嗜酸性粒细胞:嗜酸性粒细胞:CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+,CD13比比CD33表达更高表达更高正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图正常人骨髓有
11、核细胞免疫表型散点图正常人骨髓细胞免疫表型正常人骨髓细胞免疫表型 淋巴细胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+(T淋巴细胞);CD10-/CD19(B淋巴细胞)单核细胞:CD45+,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA-粒系细胞:原粒细胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+早幼粒细胞及其以下各阶段中性粒细胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+,与原粒细胞或更幼稚细胞的表型有明显差异 巨核细胞:CD45+、CD41+
12、/CD61+幼红细胞:CD45-、CD36+/GlyA+Neutrophil Maturation I II III IV V CD 45 CD 33 CD 11b CD 15 CD 34 HLA-DR CD 13 CD 16 Neutrophil Maturation Antigen Density 103 102101 Monocyte Maturation I II III 102 103 101 CD 33 CD 34 CD 11b CD 13 HLA-DR CD 14 Monocytoid Maturation Antigen Density CD 45 CD 15 AMLAML免疫
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