活体生物发光和荧光成像技术应用讲座课件.ppt

1、 1仪器结构与组成仪器结构与组成2NightOWLNightOWLLB983LB983 3视野连续可调，自动聚焦视野连续可调，自动聚焦4 3.5 cm75 cm焦距(cm)分辨率(m)3.5 50753203种荧光激发光源配件种荧光激发光源配件 环状环状照射装置照射装置 鱼尾型照射装置鱼尾型照射装置 鹅颈管照射装置鹅颈管照射装置 散射光滤光片散射光滤光片90 W 钨灯光源钨灯光源200-1100 nm可选滤光片可选滤光片56气体流量计麻醉气体蒸发器诱导麻醉箱输送管道麻醉机组成 祛除宇宙射线和背景祛除宇宙射线和背景 视野校准视野校准 定量分析功能定量分析功能 原始数据与处理后数据分开存档（根原始

2、数据与处理后数据分开存档（根据据GLPGLP规则）规则）三种图像输出模式三种图像输出模式7indiGoTM 功能强大的软件成像原理与特点8目前的活体生物体内成像技术和方向目前的活体生物体内成像技术和方向可见光及荧光成像可见光及荧光成像 -生物发光生物发光 （BioluminescenceBioluminescence）与荧光（与荧光（FluorescenceFluorescence）正电子衍射成像（正电子衍射成像（Positron-Emission TomographyPositron-Emission Tomography，PETPET）-放射性标记葡萄糖导入体内，被分裂旺盛组织吸收，常用于

3、检测肿瘤的放射性标记葡萄糖导入体内，被分裂旺盛组织吸收，常用于检测肿瘤的良恶性良恶性单光子衍射单光子衍射(Single-Photon-Emission Computed Tomography,SPECT)Single-Photon-Emission Computed Tomography,SPECT)超声（超声（UltrasoundUltrasound）-物理学方法物理学方法 计算机断层摄影（计算机断层摄影（Computed Tomography Computed Tomography，CTCT）-断层扫瞄技术，断层扫瞄技术，X-rayX-ray的衍生，物理学方法的衍生，物理学方法核磁共振（核

4、磁共振（Magnetic Resonance Imaging Magnetic Resonance Imaging，MRIMRI）-包括功能性核磁共振（包括功能性核磁共振（Functional MRIFunctional MRI，fMRIfMRI）,心血管核磁共振心血管核磁共振（Cardio-vascular MRI Cardio-vascular MRI，cMRIcMRI），），等等等等9几种常用活体体内成像技术的比较几种常用活体体内成像技术的比较10结构成像功能成像操作复杂操作简单MRI核磁共振Optical Imaging可见光成像PET/SPET正电子衍射Ultrasound超声CT1

5、1理想的光源：萤火虫荧光素酶（luciferase）基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。遗传学标记实时、原位多波长检测标记癌细胞标记细菌标记转基因鼠12荧光素酶的表达 将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表达。启动子染色体体内表达外源注入底物活跃细胞体内发光标记细胞发光强度与定量分析标记细胞发光强度与定量分析13小鼠皮下总计1000个 细胞或每mm 20个细胞可以很容易地被检测到，探测极限是一丛150 250个细胞.14生物发光活体成像方面的灵敏度在微孔细胞板中少到在微孔细胞板中少到10 个细胞可以检测到个细胞可以检测到.15生物发光微孔板检测的灵敏度

6、如何提高灵敏度1617平均肿瘤体积平均相对光单位对数值生物发光光子数与肿瘤体积呈正相关1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射生物发光的应用生物发光的应用1819活体成像技术的主要应用 标记细胞 癌症及药物研究 标记病毒,DNA,RNA 病毒学及基因治疗 转基因动物模型蛋白质相互作用、代谢、发育、内分泌学，等等 标记基因 siRNA研究的应用 干细胞,免疫 其它 细胞凋亡 组织特异性基因表达 标记细菌20体内药物分析的生物发光检测1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射14天21天28天35天雄性SCID小鼠处理方式 细胞数无治疗对照 2.2x1095-FU治疗 2.8x1

7、08丝裂酶素 3.6x106治疗 小鼠#6 n=7 小鼠#40 n=8(从第11天开始给药)小鼠#31 n=8(从第11天开始给药)21对照组于第五周结束观察生物发光强度 Exp#081雄性nu/nu CRn=13,5,7n=13n=6/7n=3/5生物发光检测体内药物治疗的复发作用5x105 ，PC3M-Luc-C6肿瘤细胞，原位前列腺癌1周3周5周7周8周生理盐水对照组（小鼠#40）静注，3次/周，第二、三周 5-Fu治疗组（小鼠#38）100 mg/kg 静注，1次/周，第二、三、四周 丝裂酶素治疗组（小鼠#4）2mg/kg 静注，3次/周，第二、三周肺癌模型22乳腺癌原位接种乳腺癌原位

8、接种23原位胰腺癌模型24白血病模型252105 Arf-/-p185+luc+LICs.2011年9月 BLOODBCL6 enables Ph1 acute lymphoblastic BCL6 enables Ph1 acute lymphoblastic leukaemia cells to survive BCRABL1 kinase leukaemia cells to survive BCRABL1 kinase inhibition inhibition 20112011年5 5月 NATURENATURE26U87 U87 脑胶质瘤成像脑胶质瘤成像 cancer resear

9、ch 2011,8cancer research 2011,827PTA of U87 humangliomas in mouse brains.A,representative bioluminescenceimages of nude mice bearingU87-TGL tumors with differenttreatments(see Materials andMethods).骨肉瘤转移机理研究骨肉瘤转移机理研究28肿瘤转移肿瘤转移29乳腺癌转移实验乳腺癌转移实验30利用转利用转基因技术自发肿瘤基因技术自发肿瘤的研究的研究31MYC inactivation uncovers

10、pluripotent differentiation and tumour dormancy in hepatocellular cancer NATURE 200432cancer cell 2004,10抗体药物研究抗体药物研究33CD137 stimulation enhances the antilymphoma activity of anti-CD20 antibodies研究干细胞造血作用研究干细胞造血作用34Cao et al,PNAS 2004Percent GFP+Cells(corrected)80706050403020100FVB N1 N2 N3 N4 N5 P1

11、 P2 P3 P4 P5 P6Total leukocytesGranulocytesB cellsT cellsDonor line crossed to FVB Cg-Tg a GFP Tg line心脏内成像心脏内成像35BMCs withgreen fluorescent protein-FLuc were administered through thetail vein 24 hours after myocardial infarction.BLI demonstrateda greater number of BMCs homed to the periinfarct regi

12、on inthe double-knockdown group,with peak homing at day 7.免疫治疗研究免疫治疗研究36EDINGER et al，2003，bloodTrafficking of CIK cells37当共转染 pGL3-luc 或HCV-luc 表达载体特异的 siRNA时，可抑制报告基因Luciferase的表达(McCaffrey et al.Nature,408,38-39,2002.Copyright permission from Nature publishing group)抑制荧光素酶(pGL3-control)抑制丙型肝炎病毒(pS

13、hh1-Ff1)外源质粒在体内表达外源质粒在体内表达 38质粒p GL3-LUC质粒，通过水动力方法注入小鼠体内后，在肝脏中与luciferase反应后大量表达实验性心内膜炎症的抗生素筛选大鼠实验性心内膜炎症的抗生素筛选大鼠模型模型39对照组vancomycinvancomycincefazolin gentamicin 细菌的感染模式研究细菌的感染模式研究40Membranous Cells in Nasal-Associated Lymphoid Tissuethe Respiratory Mucosal Pathogen Group A Streptococcus1基因治疗载体的构建基因

14、治疗载体的构建41AdTSTA-FL的表达活性比AdCMV-FL高100倍以上AdTSTA-FL（107）AdCMV-FL（107）Days 5 7 10 13800600400200500400300200100103105A genetically humanized A genetically humanized mousemodel for hepatitis C mousemodel for hepatitis C virus infectionvirus infection42体内蛋白质体内蛋白质-蛋白质之间的相互作用蛋白质之间的相互作用LUC N端 与 C端 分开时并不发光蛋白质

15、A 与蛋白质B 分别与LUC N端 和 C端 连接两组蛋白由不同的质粒诱导表达43蛋白A蛋白BLuc N端Luc C端蛋白A 蛋白BLuciferase发光相互作用+活体动物体内观察细胞凋亡活体动物体内观察细胞凋亡44LUCIILUCIILaxman,et al PNAS V.99Caspase siteCaspase site发光ApoptosisCaspase 表达活体动物细胞及组织特异性基因表达活体动物细胞及组织特异性基因表达构建双重标记的细胞株(RENILLA&FIREFLY LUCIFERASE),识别不同底物的发光酶研究基因的启动子控制 FIREFLY LUCIFERASE 表达,

16、与兴趣基因平行表达.RENILLA LUCIFERASE 作为内参,标记细胞数量45 RENILLA LucFIREFLY LucPcRen LucFir LucP53发光发光荧光和量子点标记的应荧光和量子点标记的应用用46GFPGFP标记的肺癌皮下模型标记的肺癌皮下模型47药物的肿瘤靶向性研究药物的肿瘤靶向性研究48荧光染料（荧光染料（Cy5.5)Cy5.5)标记的探针对肿瘤细胞的识别标记的探针对肿瘤细胞的识别49量子点标记成标记成像50转基因动物的应用转基因动物的应用5152基因激活 表达 生物发光 研究者可通过观察动物模型的生物发光，判断靶基因是否表达，既基因的“开”“关”现象。转基因动

17、物模型原理生物大分子合成53 血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular endothelial cell growth factor receptor 2,VEGFR2）是 VEGF的同源受体，VEGF在血管生成过程中分泌。Vegfr2-luc转基因小鼠应用从小鼠VEGFR2基因启动子及内皮细胞特异的增强子共4.5kb，以驱动荧光素酶表达。转基因动物研究原理54通过观察发育过程中,VEGFR2-Luc转基因小鼠的VEGFR2表达逐渐降低,研究生物体发育过程信号强度药物诱导的药物诱导的IL-1IL-1基因表达基因表达55荧光素酶基因标记的肿瘤细胞荧光素酶基因标记的肿瘤细胞肿瘤种类细胞种类肺癌A549，LLC乳腺癌MDA-MB-231，4T-1前列腺癌DU145，PC3胰腺癌BxPC3肝癌Huh-7,7721,hep1-6结直肠癌HCT116，lovo骨肉瘤Saos-2 卵巢癌skov356