血细胞生长课件.ppt

1、第六章 血细胞生长因子类药物第一节概述 概念对造血功能有调控作用的细胞因子，称为造血细胞因子。生物学特性 都是糖蛋白，Mr较小人的造血细胞因子基因多数位于第5及7号染色体长臂；造血细胞因子主要通过细胞旁分泌途径，也可以是自分泌，只有促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是属于内分泌多肽类生理有效浓度极低，为10-12molL造血调控由多种造血细胞因子、多种调控方式、形成造血调控网络造血细胞因子具有多能性，协同作用造血细胞因子必须与靶细胞相应的受体结合，最终作用于基因水平造血细胞因子的作用是调节造血细胞增殖和分化血细胞因子分类 按其对造血调控作用不同又可分为两大类：造血正调节因子

2、，其作用为刺激造血，如EPO、SCF、CSF、TPO和IL等；造血负调节因子，其作用为抑制造血，如干扰素、TNF和TGF-等。第二节促血小板生成素 1.血小板生成素的发现 早在1958年Kelemen就提出血液中存在一种调节血小板生成的激素样物质,并将其命名为TPO,又称为巨核细胞生长与发育因子或巨核细胞生成素(MGDF)。20世纪90年代人们在研究小鼠髓性增生性白血病(MPL)病毒癌基因时,克隆了它的同源物,发现该基因同源物的表达产物是一种细胞因子,主要表达于血小板、巨核细胞和骨髓细胞。Desauvage等用亲和层析法纯化了猪的MPL癌基因同源物配体,随后克隆了人的配体,发现该配体具有TPO

3、特性,就是人们长期以来所寻找的促血小板生成素TPO。2、来源 TPO来源于肝、肾和骨胳肌细胞3.基因和分子结构 基因：3q26.33-27,长6.2kb,6个外显子，个内含子 ro-TPO:353AA，21AA信号肽 TPO：332AA，Mr 68-85kD(因其糖基化量而变化)，糖蛋白，无糖基化时，r 38kD。糖基化对TPO分子的稳定，延长体内半衰期起重要作用。内源性TPO：人TPO基因位于3号染色体，相对分子质量为36103基因重组TPO：332AA，Mr 68-85kD(因其糖基化量而变化)，糖蛋白，无糖基化时，r 38kD。糖基化对TPO分子的稳定，延长体内半衰期起重要作用。TPO两

4、个结构域：EPO样N端结构域：是由153AA，有完整的TPO活性，与EPO同源，且高度保守。在该区中有4个Cys，形成两对二硫键。这两对二硫键是维持TPO活性所必需。富糖基化的C端结构域：179AA，有6个N位的糖基化位点,与目前已知的任何细胞因子无同源性。起稳定分子，延长半衰期的作用。两个结构域之间有两个串联的精氨酸连接。4.TPO分子结构改造 TPO的活性集中于端结构域：将7,29,85和151位的半胱氨酸分别用丙氨酸替代,4个突变体均无TPO活性。将端切短,表达的一系列的TPO分子(1-231,1-211,1-191,1-171,1-163,1-157,1-151),均有TPO生物活性。

5、TPO(1-150)仅因缺少了151位的半胱氨酸而完全丧失了生物活性。TPO分子中二硫键对TPO的生物活性是必不可少的,C端结构域的任何潜在的糖基化对TPO的受体结合和信号传导都不是必需的。EPO-TPO（C）融合蛋白：具有EPO生物学活性，延长了EPO半衰期。5.生物学功能（1）体外作用 TPO对巨核细胞的发育、成熟，最后分化成血小板的整个过程都起作用。体外研究表明TPO可促使巨核系集落形成单位(CFU-MK)增殖,能促进巨核细胞增殖与分化成熟,增加巨核细胞体积以及血小板特异性抗原的表达（2）体内作用 TPO可以促进早期红系祖细胞，粒细胞-巨嗜细胞系集落形成单位（CFU-GM）和定向巨核系祖

6、细胞（CFU-MK）的增殖。对外周红细胞无影响，仅对巨核细胞系有特异作用。与EPO、G-CSF、干细胞因子(SCF),及-3等细胞因子协同作用,共同促进红系和粒系祖细胞增殖,促使造血细胞干细胞进入增殖周期。TPO的作用机理 诱导造血干细胞向巨核细胞分化；刺激巨核细胞增殖和核内复制；增加巨核细胞的胞浆底物，最终形成碎片；促进血小板的生成；释放功能性循环血小板6.临床应用前景 治疗因癌症放化疗引起的血小板减少症、干细胞移植后血小板的恢复 临床实验表明TPO能有效地减轻化疗后血小板降低的程度及缩短其减少的持续时间,促进血小板计数恢复,并减少血小板输注需求。TPO虽能有效地促进非造血系统肿瘤化疗后血小

7、板生成,但对造血系统肿瘤化疗后的作用并不理想。在造血干细胞移植的应用方面,40例乳腺癌患者进行自体骨髓移植后使用PEG-rHuMGDF治疗,血小板恢复到正常的时间较安慰剂组缩短了5-6,血小板输注次数减少了48%。但TPO对自体外周血干细胞移植患者无效。7.TPO毒副作用 此外,TPO长期或大剂量应用存在以下潜在的毒副作用 刺激肿瘤细胞生长 与其他细胞因子产生竞争性相互作用 骨髓纤维化 肝脾肿大等8.临床应用前景 目前进入临床研究的重组TPO主要有两种：一种是全长分子的重组人促血小板生长素(rhTPO)另一种是半长分子(聚乙二醇化)的聚乙二醇-重组人巨核细胞生长发育因子(PEG-rHuMGDF

8、)。PEG-rHuMGDF的应用使10%的健康志愿者产 生中和性抗体,并能与内源性TPO产生交叉反应,导致血小板减少,因此PEG-rHuMGDF的临床研究已被中止,而rhTPO则尚无引起抗体产生的报道,其临床试验仍在继续。来源：肾脏是EPO产生的主要来源，由肾小管基底膜外侧的肾小管周围间质细胞产生。肝脏中Kupper 细胞和骨髓中巨噬细胞也产生EPO。诱导因素：组织缺氧是诱导EPO产生的主要刺激因素，受组织氧分压的调节。作用：促进红细胞系列的增殖、分化和成熟。第三节：促红细胞生成素（EPO）1.简介肾脏对EPO产生的调控作用 在成人体内,EPO绝大部分由肾脏产生,少量来自肝脏(胎儿及新生儿则主

9、要依靠肝脏产生)。机体缺氧是肾脏分泌EPO的基本动力,肾脏通过相应细胞(肾皮质细胞等)感受机体血氧浓度的变化,对EPO的产生进行调控,从而参与红细胞生成的过程。即一旦机体表现缺氧(由贫血、血容量减少等引起),肾脏便分泌大量的EPO进入血液,随血液循环到达骨髓,作用于造血干细胞,促使红细胞增生,直到红细胞的携氧量达到机体正常水平;而当机体接受血液输入时,由于大量红细胞的涌入,导致血氧浓度提高,就会抑制肾脏EPO的产生。2.基因和分子结构 人EPO基因：7q1112区，5.4kb长，有4个内含子和5个外显子。ro-EPO：l93AA，27AA 成熟EPO：166AA,有两对二硫键（7-161，29

10、-33），天然EPO是一种含唾液酸的酸性糖蛋白。由CHO细胞表达的人重组EPO的相对分子质量为30400。分子中60为蛋白质，糖占40。糖基化：EPO的糖基包括3个N-糖链(分别位于24、38、83)和一个O-糖链(位于Ser126)。它们的主要成分是甘露糖、岩藻糖和唾液酸。其中,唾液酸在维持EPO分子的酸性、防止EPO失活等方面有重要作用。去糖基化不影响EPO体外生物活性，但却缩短了在体内的半衰期，使其在体内完全丧失活性。因此，糖基化对EPO十分重要。只有在真核细胞中表达的EPO在体内才能发挥作用。性质：重组EPO对热稳定，在80不变性。能耐受有机溶剂如丙酮，95乙醇。对蛋白变性剂如6mol

11、L盐酸胍，8molL尿素也有耐受性。pI4.5，在pH3.5l0活性稳定。对蛋白酶，烷基化及碘化作用敏感。二硫键打开后生物活性丧失。EPO制剂不宜冻干，通常制成含蛋白保护剂的水溶液。3.生物学活性(1)促进红系细胞的生长、分化和增殖，促进红系池的扩大 红细胞是由骨髓中的干细胞分化、增殖，再经红细胞样爆发形成单位(BFU-E)和红细胞样集落形成单位(CFU-E)、最后作为成熟细胞释放至血液中的。EPO刺激骨髓中红细胞样前体细胞发生CFU-E和BFU-E。(2)促进红细胞成熟 使成熟速度明显加快，如细胞体积变小，核仁消失，核浓缩，血红蛋白含量增加等。(3)抗氧化作用 稳定红细胞膜，提高红细胞膜抗氧

12、化酶的功能。4.EPO临床应用(1)肾功能衰竭所致的贫血 肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射EPO来提高体内EPO水平进行治疗，从而帮助病人增加红细胞数量，此时EPO水平有所上升。(2)癌性贫血 (3)结缔组织病贫血 (4)骨髓增生异常综合症贫血125.其他用途：1、医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。2、体育用途(兴奋剂)：增加训练耐力和训练负荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。在2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂 3、是对红细胞的生成有增强作用的细胞因子。为分子量6-7万的糖蛋白，糖的含量多，已证明血和尿中都有它的存在。未分

13、化的干细胞分化成红细胞系干细胞（erythropoietin responsive cell），促红细胞生成素在此发挥作用，使之变为前成红细胞。对进一步再成熟为成红血细胞、网织红细胞，血红蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促进作用。一般在贫血和低氧状态时，根据身体组织对氧的需要，促红细胞生成素的供给量将增加，但在肾脏贫血时其含量则非常低。其生成器官和机制虽尚未清楚，可是作为某肾脏因子（renal erythropoietic factor）与血浆的基质反应产生肾小球的说法是有力的。此外，起着相当于促红细胞生成素作用的因子中，促进白细胞生成的有colony stimulating factor，促

14、进血小板生成的为促血小板生成素，包括促红细胞生成素在内，统称为造血促进因子。6.用法用量：静脉注射开始应用较低剂量，每周次，如果在周内，网状红细胞计数、血细胞比容和血红蛋白水平未见明显增加，本品的剂量可递增，如果在任何周中血细胞比容的增加大于 以上，本品的剂量应减少，建议以血细胞比容达或血红蛋白水平达为指标，调节维持剂量，同时应个别测定最佳血细胞比容的水平。接受长期血液透析的患者，通常在每一次透析过程结束时给予本品。皮下给药剂量与静注相同。腹膜内给药剂量等于或大于静注剂量。7.EPO的副作用 本品的主要副作用为血压升高和惊厥等，高血压病人慎用或禁用。使用过量rhEPO对人体造成的伤害:通过促使

15、红细胞额外增加,红细胞压积(Hct)急剧上升,造成血液流动变缓,凝血加快,增加了静脉血栓、肺栓塞、肌肉感染、中风以及高血压、癫痫的突发几率。偶见瘙痒感、皮疹、痤疮、GOT或GPT值升高、恶心、呕吐、眩晕、头痛、发热、血钾升高等。血液透析不能控制动脉血压升高的患者，白血病、铅中毒及感染患者禁用，有药物过敏者、变态反应体质者慎用。应及时对用本品治疗者的血压进行监测，必要时给抗高血压药物。应注意血管栓塞情况，有时需增加肝素的剂量。必要时补铁，使患者的转铁蛋白饱和度维持在20以上。由于EPO在体内的作用巨大而天然来源却十分有限(主要从贫血患者的尿中提取)，人们便开始利用基因重组的分子，它由不同的糖化体

16、构成，各种糖化体的区别主要表现在糖基在整个分子中所占的比例不同，它一方面能够刺激骨髓造血功能，及时有效地增加红细胞的数量；另一方面能够增强机体对氧的结合、运输和供应能力，有利于在高强度竞技时改善缺氧状态，促进肌肉中氧生成，使肌肉更有力、工作时间更长，从而增强运动能力。长期使用rHuEPO，对运动员来说，可能会带来一时的荣誉，但给其健康带来的却是永久的危量过度增加，当血红蛋白含量超过55时，血液粘滞度就会增高，同时血流也会变慢。加上外界因素如运动脱水、环境压力和不合理医务监督等，当血红蛋白含量升高至65甚至70以上时，血流速度过慢，引起工作肌缺氧，有可能导致静脉微血栓形成，从而引起肺栓塞、中风和

17、死亡。8.最新EPO检测方法（Nature）1988年出现了与 天然EPO活性几乎相同的重组人EPO产品,它能 够改善机体携氧能力,明显提高人体的红细胞数量 及血红蛋白含量,从而提高人体运输氧的能力,提高 人体最大摄氧量,增强人体耐力,对肌体的有氧工作能力有明显的促进作用,可减少肌体的运动性疲劳,故而有人在比赛或赛马中滥用,以提高运动成绩。因此,从1990年起,国际奥委会(International O lympic Comm ittee,IOC)正式将EPO列为禁用 药物2。血液中正常EPO含量为3.3-16.6mIU/ml EPO兴奋剂与人体自然生成的促红细胞生成素几乎 没有区别，而且半衰

18、期短，注射后会较快地从人体中消失，给检测增添了难度。弗朗索瓦丝拉纳与雅克索里兹教授 长期合作研究后发现，合成的EPO与人体中自然生成的 EPO在电荷上存在着细微差别，因而可以将二 者区分。在此基础上，两位科学家发明了准确检测EPO 兴奋剂的新方法。新方法只需采集被检者的 几滴尿液，便可检测出当事人在天内是否接受过EPO 兴奋剂注射。他们进行的测试显示，新方法具有极高的检测成功率。rhEPO的氨基酸序列与正常EPO完全相同,仅有糖基部分有微小的差别此,目前可以肯定的rhEPO与EPO在结构上的不同是N-端唾液酸含量差异。分子中所含唾液酸残基数量的不同,或者胺基化等其它原因引起分子整体电荷的差异。

19、所以rhEPO与正常内源性的EPO相比存在一个较低的负电荷。借助琼脂糖凝胶柱进行电泳,再利用RIA（荧光免疫分析法）法使各成分在阴极获得指示并检出,发现结果与判断一致:rhEPO糖化体比正常EPO糖化体晚出峰。该方法在24h以内EPO的检出率达100%,48h以内达75%。尿样中EPO比血液中EPO更显酸性，在电泳速度上会更加有利。注射EPO后，尿样中EPO的增加比血液中要大。常用琼脂糖凝胶电泳，等电聚焦，高效毛细血管电泳。目前人们对EPO检测采取的是直接法与间接法结合使用。2008年,悉尼运会便是采用这一模式,通过血检加尿检的方法:首先利用血检进行粗筛,借助Robin等提出的5项指标取得一个

20、综合值,将其与正常值比较,挑出可疑者,然后将可疑者的尿样进行电泳,实施直接检测。这种模式是目前所能采用的最有效率和说服力的检测形式,在一定程度上解决了竞技体育中EPO检测的难题。rhEPO的使用会不可避免地导致全血或血清 中一些生理生化指标的改变。这些指标包括 可溶性转铁蛋白受体和与血红细胞及网织红细胞相 关的各种参数,如红细胞压积(Hct)、血红蛋白含量(Hb)、网织红细胞压积(reticulocyte hematocrit,RetHct)、可溶性转铁蛋白(sTfr)浓度、血清中EPO 浓度及巨细胞百分数(%Macro)等。依赖于对 这些间接指标的检测,与没有使用rhEPO的正常人 的评价结

21、果相比较,可查明运动员是否滥用rhEPO。.EPO生产状况重组生产：重组技术生产的rHuEPO是一种酸性糖蛋白，分子量为298士03kDa，于1985年问世并成为注册药物。它由启动子构建成表达载体后，以不同的细胞株有中国仓鼠卵细胞(CH0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)及C127小鼠纤维细胞3作为受体进行表达，获取rHuEPO，所以rHuEPO的氨基酸序列与正常EPO完全相同，仅糖基部分有微小差别。由此可见，rHuEPO与EPO在结构上的不同是N-端唾液酸含量的差异。-Darbepoetin也称新红细胞生成刺激蛋白(novel erythropoiesis stimulating protein，N

22、ESP)，其商品名为Aranesp，是一种高糖基化的rHuEPO类似物。Darbepoetin同样能够促进红细胞的产生，并且其不良反应发生率和死亡率都与rHuEPO相似，但Darbepoetin可能引起的高血压和凝血事件比rHuEPO少。由于它与禁药目录中的EP0有同样的功效，所以同样也属于禁用药物。Darbepoetin含有5个N一糖链和比rHuEPO多的唾液酸残基。与rhEPO不同的是,DPO有5个糖基化位点,而不是3个;DPO的糖基化位点增加,相应的其唾液酸含量也随之明显增加,与内源性和基因重组的EPO相比,DPO的唾液酸含量更高。这两个额外的、包含硅酸的N多糖链按顺序被放在EP0肽链主

23、干的氨基酸位置上，既不改变蛋白质的结构，也不影响与受体的结合。Darbepoetin的分子量(36804kDa)比rHuEPO大，其糖基含量也由40增加到52。由于糖基含量的增加，它的半衰期比rHuEP0延长2倍，体内的药效作用时间更长久。并且Darbepoetin有较好的代谢稳定性和较长的半衰期，持续时间比10倍剂量的rHuEPO还要长，所以可以延长给药的时间间隔，减少给药次数口，是临床用药的又一重大突破。2001年,市场上又出现了一种新近开发的红细胞生 成刺激蛋白(erythropoiesis stimulating protein,NESP),也称Darbepoietin-(DPO),它

24、是在促 红细胞生成素分子的基础上进一步改造形成的,这就赋予了它更长的 半衰期和生物活性。表达系统表达载体细胞株与培养过程工艺过程培养工艺控制分离纯化过程 采用Bellco公司转瓶机,用无血清培养基培养分泌RhEPO的工程细胞株CHOEPO-2.所收集的上清液预处理后经染料亲和层析-离子交换层析-分子筛层析纯化后,所得EPO纯度达99%以上,比活性大于1.5105IU/mg,整个纯化全过程的EPO体内活性回收率为45%.所纯化的EPO分子量为37kD.分析表明,所纯化的EPO可与抗EPO的单克隆抗体特异性结合.该工艺纯化路线简单,重复性好,生产成本低,产品活性高,适合大规模生产重组人促红细胞生成

25、素.红细胞生成素，超级“重磅炸弹”基因药物 1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人EPO（rhEPO），1989年安进（Amgen）公司的第一个基因重组药物Epogen获得FDA的批准，适应症为慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血等，其市场表现不俗，1999年销售值达到17.6亿美元，2000年19.6亿美元，2002年22.6亿美元，2003年24.4亿美元，成为名副其实的“重磅炸弹”基因药物。安进（Amgen）开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到FDA的批准，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp是一

26、种“高糖基化”促红素产品，其促进红细胞生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们红，Aranesp2002年全年销售额为4.2亿美元，2003年全年销售额为15.4亿美元。估计在今后3年内，Arnesp将创造10亿15亿美元的市场销售额并夺取现有EPO生产商的部分市场，其市场前景不可估量。2001年，EPO（包括Arnesp）的全球销售额达21.1亿美元，2002年达26.8亿美元，2003年全世界EPO的年销售额超过50亿美元。创下生物工程药品单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物。强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成素Proc

27、rit/Eprex更是表现不俗，2001年销售额34.42亿美元，2002年销售额42.69亿美元，2003年销售收入达到39.84亿美元。目前，国内已有10多家单位获准生产红细胞生成素。沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国）生物药业的产品在国内医院的销售额独领风骚，2001年EPO的国内医院销售总额约为47449万元，2002年为49508万元，2003年上半年为28606万元。估计国内的年市场容量在20到30亿元左右，但目前年销售额只有区区5亿元左右。第四节 集落刺激因子类药物（CSF）一、集落刺激因子概述 最初研究造血干细胞是从软琼脂的半固体培养基开始的，在这种培养基中，造血干细胞分化增殖产生的

28、大量子代细胞由于不能扩散而形成细胞簇，称之为集落，而一些细胞因子可明显刺激这些集落的大小和数量，因而命名为集落刺激因子（CSF），是一组控制粒细胞，单核-巨噬细胞和某些有关的造血细胞增殖和分化的糖蛋白。集落细胞刺激因子：能刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化，并使之在半固体培养基中形成细胞集落的细胞因子(一)分类：.集落刺激因子（colony Stimulating factor，CSF）根据与粒细胞和巨噬细胞增殖的关系，按生成的集落命名,被分为四种：粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating facto

29、r，GM-CSF）、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）多潜能集落刺激因子（multipotential-colony stimulating factor multi-CSF），又称白介素-3（interleukin-3，IL-3）。2.根据CSF刺激细胞所形成克隆的细胞类型特点划分，分为两类：作用于造血干细胞:multi-CSF,GM-CSF 作用于成熟的造血祖细胞及分化的特殊系列细胞：M-CSF,G-CSF G

30、-CSF主要来源于巨噬细胞、内皮细胞和纤维母细胞。既能高度特异性地刺激中性白细胞系前体细胞的存活、增殖和分化，又是成熟的中性白细胞的功能活化因子。在维持体内中性白细胞水平和活性上起重要作用。GM-CSF主要来源于细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞和纤维母细胞。既能刺激骨髓祖细胞增殖、分化形成粒细胞和巨噬细胞集落，还能刺激嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的前体细胞及早幼红细胞和多能祖细胞的初期增殖。同时GM-CSF还可以促进成熟造血细胞的产生，增强成熟细胞对细菌和寄生虫感染的反应能力。M-CSF主要来源于巨噬细胞、纤维母细胞、单核细胞。能增强巨噬细胞的细胞毒性，是集落刺激因子中唯一没有种间特

31、异性的集落刺激因子。Multi-CSF来源于活化的细胞。它作用于更为原始的靶细胞，如作用于一些具有自我更新能力的多能造血干细胞和祖细胞，产生嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨核细胞。1981年Ihle等发现ConA刺激小鼠脾细胞的培养上清中含有一种因子，能提高裸鼠脾脏淋巴细胞成熟淋巴细胞标志20-羟固醇脱氢酶(20-hydroxysteriod dehydrogenase,20SDH)的阳性率，命名为白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)。由于IL-3可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化，又称为多潜能集落刺激因子(multi-CSF)。二）四种二

32、）四种CSF的异同点的异同点相同点相同点它们都有刺激造血细胞增殖作用，促进非增殖细胞进入它们都有刺激造血细胞增殖作用，促进非增殖细胞进入增殖周期。增殖周期。这四种集落刺激因子都是低分子量的酸性糖蛋白，相对这四种集落刺激因子都是低分子量的酸性糖蛋白，相对分子质量约为分子质量约为1400090000。大多都是单链多肽（大多都是单链多肽（M-CSF除外）除外）基因多位于基因多位于5号染色体上（号染色体上（G-CSF除外）除外）差异点：人G-CSF基因位于17号染色体上，GM-CSF、multi-CSF和M-CSF基因均位于5号染色体上。各自的产生细胞和靶细胞有一定差别。GM-CSF由T淋巴细胞、单核

33、巨噬细胞、内皮细胞和纤维母细胞产生，靶细胞有中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞。G-CSF由巨噬细胞、内皮细胞和纤维母细胞产生，作用的靶细胞有CFU-G（粒细胞集落形成单位细胞）和中性粒细胞。M-CSF由许多细胞都能产生，其作用的靶细胞有CFU-M（巨噬细胞集落形成单位）和单核、巨噬细胞。multi-CSF是由T淋巴细胞产生，作用于较早期祖细胞，靶细胞有单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，中性粒细胞不表达multi-CSF的受体。M-CSF是两条相同肽链通过二硫键连接的二聚体。G-CSF和GM-CSF生物学作用的异同点(1)G-CSF特异性刺激中性白细胞，而GM-CSF则是所有粒细胞的总刺激

34、因子。若要通过提高嗜酸性效应细胞水平来治疗寄生虫感染，则GM-CSF作用比G-CSF为好。(2)GM-CSF是单核细胞和巨噬细胞的强激活剂，而G-CSF则不是，如需要提高单核细胞和巨噬细胞活性，可选用GM-CSF，而不是G-CSF。(3)GM-CSF是中性白细胞移动的强抑制剂，而G-CSF则会增强中性白细胞的移动。当局部损伤时，GM-CSF可在局部产生，起弱的化学诱导剂作用，抑制炎症细胞离开炎症部位，而G-CSF则能增强炎症细胞向炎症部位移动。二、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）1、诱导和产生：主要由内毒素、TNF-和IFN-活化的单核细胞和巨噬细胞产生。2、基因与分子结构：基因：17号染色体

35、，与IL-6高同源性。1986年cDNA 克隆成功，.5kb,个外显子，个内含子。分子结构：人类有两种不同的G-CSF cDNA，分别编码含207和204氨基酸的前体蛋白，均有30个氨基酸的先导序列 成熟两种分子形式：174AA 177AA：N端35位处插入3AA，其余序列与174相同，活性提高20倍。5个Cys（36-42，64-74，17游离）对17位改造Cys17-Ala17,稳定性活性均提高。Mr21kD3.性质：人G-CSF分子量为19.6kDa，PI6.1，O-糖基化,对酸碱(pH210)、热以及变性剂等相对较稳定。人重组G-CSF的临床研究证明,它能显著提高人粒细胞的数量,尤其是

36、在各种原因引起白细胞下降的病人，并且作用迅速,副作用小。但G-CSF也存在体内半衰期短和体外贮藏稳定性较差的缺点,影响了它的广泛应用。许多研究表明,细胞因子不稳定因素可能与其结构相关。人G-CSF在17位有一个游离的半胱氨酸和两个硫键(Cys36-Cys42和Cys64-Cys74。已知白细胞介素-2也有一个游离的半胱氨酸,易形成分子间的二硫键,产生无活性的寡聚体。丝氨酸或丙氨酸取代IL-2 Cys125产生的突变克隆具有较高的稳定性。利用新的技术路线进行了人重组G-CSF-Ala17的构建和表达,发现G-CSF-Ala17较野生型G-CSF除具有更高的稳定性外,还具有更高的体内生物学活性。利

37、用定向点突变技术,将人重组粒细胞集落刺激因子第17位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列。DNA序列分析证明后,在大肠杆菌中表达突变蛋白。利用G-CSF依赖细胞株NFS-60,对在不同温度及在人血浆中保存的G-CSF蛋白(G-CSF-Ala17)和野生型的G-CSF进行活性测定。腹腔注射后小鼠外周血白细胞计数检测其体内生物学活性。DNA序列分析表明17位半胱氨酸突变为丙氨酸,并在大肠杆菌中表达成功G-CSF-Ala17。纯化的突变蛋白对NFS-60细胞具有刺激活性;与野生型G-CSF相比,在各种温度储存的突变蛋白保留更高的活性,与人血浆孵育50小时后突变蛋白仍保持活性;小鼠一次性体内注射突变

38、蛋白后外周血白细胞数明显高于野生型G-CSF。G-CSF突变体(G-CSF-Ala17)较野生型的G-CSF具有更高的体外稳定性和体内造血刺激活性 G-CSF-Ala17突变体蛋白,体外比活性与野生型G-CSF相比,虽然活性相同,但前者的体外稳定性明显改善,并且体内生物学活性明显增加。G-CSF-Ala17在减少游离半胱氨酸后,不仅提高了结构的稳定性,而且具备了较强的抵抗外界影响的能力,特别是在血浆中的抗降解能力,提示其在体内可能有延长半衰期的作用。G-CSF-Ala17有可能作为新一代的基因工程药物,更利于生产、贮藏和运输,并且由于其体内半衰期的延长,可减少使用剂量和延长用药间隔,并降低副作

39、用,因而可能具有良好的开发应用前景。4.生物学功能 G-CSF主要作用于中性粒细胞系造血细胞主要作用于中性粒细胞系造血细胞的增殖、的增殖、分化和活化。分化和活化。在体外G-CSF刺激骨髓造血祖细胞中中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞。最近研究表明，单独G-CSF或与SCF协同可促进多能造血干细胞的增殖、干细胞母细胞集落形成。G-CSF还具有对人粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及成肌纤维细胞的趋化作用。肿瘤患者注射G-CSF后可提高血循环中中性粒细胞的水平，这种作用可能与缩短某些骨髓细胞进入S期的时间以及增加生成粒细胞的祖细胞数量有关。1）对多能造血干细

40、胞的作用：缩短多能造血干细胞的静止期，诱导其进入细胞周期。与IL-3作用叠加，促进干细胞集落的形成 2）对粒细胞、巨噬细胞系前驱细胞（CFU-GM）的作用：促进骨髓粒细胞系的早幼粒细胞的增殖、分化及成熟 提高中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）活性 促进中性粒细胞及干细胞释放于外周血中3）提高中性粒细胞机能作用：增强对成熟红细胞补体受体膜表达；提高对外来异物的粘着能力；4）对单核细胞作用：诱导单核细胞的游走；5）对血管内皮细胞的作用：诱导血管内皮细胞的游走及增殖，与组织修复相关。5.临床应用 放化疗后中性白细胞减少症 慢性白细胞减少症 骨髓移植 其它6、不良反应（1）骨痛 应用G-CSF每日5g/k

41、g后，有1539%病人产生骨痛（2）流感样症候群 包括发热、肌痛、乏力、头痛、恶心、呕吐、关节痛、厌食、腹泻等。糖基化制剂比非糖基化制剂不良反应少。（3）毛细血管渗漏综合症 发生较少，偶见体液潴留、浆膜腔积液、低血压、呼吸困难、血栓形成等。（4）其它 少数病人可出现皮症、血小板减少、局部注射处反应等。在白血病发作期，骨髓有大量白血病细胞时不宜应用。7.G-CSF的生产 1991年FDA批准进入临床 1997年我国批准临床使用 重组人粒细胞集落刺激因子（rHuG-CSF）是将人粒细胞集落刺激因子基因与载体重组，再转化进入大肠杆菌或CHO细胞后的表达产物。由E.coli表达的非糖基化G-CSF，由

42、175个氨基酸组成，N-端多一个甲硫氨酸,生物活性与天然G-CSF完全相同。用CHO细胞或家蚕细胞和幼虫表达G-CSF，具有糖链，在体内更稳定。三、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）1、发现 1977年Burgess等从小鼠肺条件培养液中发现一种能刺激粒细胞和巨噬细胞形成集落的因子，命名为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。1984年和1985年小鼠和人GM-CSF的cDNA分别克隆成功。2、诱导与产生 T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞等均可产生GM-CSF。其中T细胞和巨噬细胞一般在免疫应答或炎症介质刺激过程中直接产生，而内皮细胞、成纤维细胞可能通过IL-1和TNF

43、的诱导而产生。人的IL-4、IL-5、M-CSF、M-CSF受体(C-fms)和早期生长应答基因-1(early growth response gene-1,EGR-1)也位于第5号染色体的长臂。表4-6 人第5号染色体上某些生长因子、受体和CD抗原的基因细胞因子IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、M-CSF、GM-CSF、ECGF（内皮细胞生长因子）受体M-CSFR(C-fms)、PDGFRCD抗原CD14、CD49a、CD49b其它EGR-1 3、基因和分子结构 基因：人和鼠GM-CSF基因DNA序列有高度同源性，基因组约2.5kb长，包括4个外显子和3个内含子。小鼠GM-CSF基

44、因位于11号染色体。而人的则位于第5号染色体长臂，在IL-3基因下游9kb处。分子结构：人和小鼠GM-CSF分别由144和141氨基酸残基组成，均包含17氨基酸的先导序列。成熟的人和小鼠GM-CSF分子分别由127和124个氨基酸残基组成，在氨基酸水平上有54同源性，但生物学作用具有种属特异性。GM-CSF含有高度保守结构的2个链内二硫键，其中51与93位之间形成的二硫键对该因子的生物学活性有重要作用。性质：重组GM-CSF pI 5.4。4.结构特点：1-96含有与受体结合部位 97-121对于稳定1-96位与受体结合有重要作用。110-127含有与受体结合的重要部位。GM-CSF分子中第1

45、618，2131和7894氨基酸残基对刺激造血功能极为重要。糖基化程度不同的GM-CSF生物活性无明显不同，也有报道，大肠杆菌表达的非糖基化GM-CSF比真核细胞表达的GM-CSF具有更高的生物活性。不同重组表达体系的表达量的比较：目前常用表达体系：大肠杆菌：包涵体形式，分泌型表达(表达量，20mg/L），加工步骤较为繁琐。酵母菌：将GM-CSF基因克隆到信号肽基因下游，用定位突变的方法除去之间的连接序列，在启动子调控下，于酵母中表达并分泌到胞外，表达量可达50-60mg/L。哺乳动物细胞：表达量低，难于大规模生产。不同表达体系GM-CSF生物学活性比较 三种体系表达的GM-CSF主要区别在于

46、N-位点及O-位点的糖基化。E.coil-GM,N-位点及O-位点均未糖基化，Mr14.6kD，在升高白细胞和中性粒细胞恢复方面有优势，短时间用药，不产生抗体，长时间连续用药产生抗体，其抗体与内源性GM-CSF起交叉反应。Yeast-GM,仅N-位点糖基化，O-位点均未糖基化，Mr15.6-30kD，毒副作用较轻，在升高白细胞和中性粒细胞恢复方面有同上的优势，用药产生的抗体与内源性GM-CSF不发生免疫反应。CHO-GM，N-位点及O-位点均糖基化Mr18-24kD，用药产生的抗体与内源性GM-CSF不发生免疫反应。5.GM-CSF受体 人和小鼠GM-CSFR均由、两条链组成 链：低亲合力受体

47、，GM-CSF与其受体链结合，激活单细胞为主 链单独不结合配体，但与链共同组成高亲和力受体，在信号转导中起主要作用。链为IL-3、IL-5受体所共用，GM-CSF与其受体 链结合，调节成熟细胞功能为主 GM-CSFR、两条链胞膜外结构均属于造血因子受体超家族(或称红细胞生成素受体超家族)成员。GM-CSFR的分布:GM-CSFR主要分布于髓系细胞,但分布的方式有所不同。在中性粒细胞表面仅有GM-CSFR的和链,而无IL-5R和IL-3R 的链，因而IL-3、IL-5对GM-CSF与中性粒细胞表面GM-CSFR结合不发生竞争，由于链数目少于或等于链的数目,所以中性粒细胞表面仅有高亲和力GM-CS

48、FR，而无低亲和力受体。IL-3、GM-CSF两种细胞因子均可作用于单核细胞，而且可以相互竞争结合。单核细胞可同时表达IL-3、GM-CSF的高亲和力受体，也表达这两种低亲和力受体，在单核细胞表面这两种细胞因子受体链表达的数目多于链。在嗜酸性粒细胞表面同时表达IL-3、IL-5和GM-CSF三种受体，而且IL-3、IL-5和GM-CSF三种配体均可相互竞争抑制。嗜碱性粒细胞亦具有这三种受体，但结合相应配体的能力依次是GM-CSFIL-3IL-5。6、融合蛋白研究 GM CSF/IL-3融合蛋白 由于GM-CSF与IL-3有类似的生物学活性，它们的基因在人体细胞染色体上紧密连锁，都位于第5对染色

49、体，并且共享同一条信号传导受体链，因而两者连接构成的融合蛋白可以产生协同效应。美国西雅图公司首先研制成功酵母表达的GM CSF/IL-3融合蛋白，商品名为Pixy321。N端为GM-CSF，C端为IL-3，中间有15个氨基酸的连接肽，保证融合蛋白中GM-CSF和IL-3肽链各自折叠成天然的二、三级结构。其活性较GM-CSF或IL-3高二十倍,亲和力增加5-10倍，尤其在促血小板恢复方面，优势明显。临床研究显示，22例应用Pixy321的病人只有8例为抗体阳性，而且这些抗体均不具有中和Pixy321的活性的作用，说明其临床应用是安全的。其对癌症病人放疗、化疗后，骨髓移植后造血功能的恢复有明显的促

50、进作用，同时能提同粒细胞、血小板数目，对红细胞，巨噬细胞数目也有促进。GM-CSF/EPO融合蛋白：Coscarela A 等首先制备成功GM-CSF/EPO融合蛋白，比单个细胞对造血系统有更强的综合促进作用，临床研究表明对于癌症放、化疗和骨髓移植后造血功能的恢复有更为明显的促进作用，有希望成为临床使用的新一代高效造血刺激物。7、生物学活性（1）促进造血祖细胞增殖/分化，尤其是那些生产中性粒细胞（粒细胞的变种）和巨嗜细胞的造血祖细胞。对于嗜酸性细胞、红细胞和巨核细胞，GM-CSF也有促进其增殖和分化的作用。体内研究也证明，这种细胞激素能提高造血能力。（2）刺激骨髓细胞形成，CFU-G，CFU-