蛋白质氨基酸测定课件.ppt

1、蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定 o概述概述o凯氏定氮法凯氏定氮法o蛋白质的快速测定法蛋白质的快速测定法o氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定o氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定概述概述（1）蛋白质的生理功能及在食品中的作用（2）食品中的蛋白质含量（3）蛋白质系数（4）蛋白质测定方法概概 述述 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。重要成分，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体的酸碱平衡、水平衡的维持；人体的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；遗传信息的传递；物质的代谢及运

2、转都与蛋白质有关。物质的代谢及运转都与蛋白质有关。人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物来构成人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质自身的蛋白质，是人体重要的营养物质 食品的重要营养指标。食品的重要营养指标。(2)(2)食品中的蛋白质含量及测定意义食品中的蛋白质含量及测定意义在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来来动动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为质含量为20.0%20.0%左右，猪肉中为左右，猪肉中为9.5%9.5%

3、，兔肉为，兔肉为21%21%，鸡肉为，鸡肉为20%20%，牛乳为，牛乳为3.5%3.5%，黄鱼，黄鱼为为17.0%17.0%，带鱼为，带鱼为1818.0%.0%，大豆为，大豆为40%40%，稻米为，稻米为8.5%8.5%，面粉为，面粉为9.9%9.9%，菠菜为，菠菜为2.4%2.4%，黄瓜为，黄瓜为1.0%1.0%，桃为，桃为0.8%0.8%，柑橘为，柑橘为0.9%0.9%，苹果为，苹果为0.4%0.4%和油菜为和油菜为1.5%1.5%左右。左右。测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合合理开发利用食品资源理开发利用食品资源、提高产品质量

4、提高产品质量、优化食品配方优化食品配方、指指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。（3 3）蛋白质的性质）蛋白质的性质蛋白质是复杂的含氮有机蛋白质是复杂的含氮有机化合化合物，分子量很大，大部分高物，分子量很大，大部分高达数万达数万 数百万数百万。从组成上看：从组成上看：化学元素化学元素C C、H H、O O、N N（P P、S S、CuCu、FeFe）；）；它们由它们由2020种氨基酸通过种氨基酸通过酰胺键酰胺键以一定的方式结合起来，以一定的方式结合起来，官能基团官能基团：肽键、氨基酸残基、酸碱基团、芳香基团：肽键、氨基酸残基、酸碱基团、芳香基团

5、结论：结论：含含氮氮是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。不同的不同的蛋蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其不同的蛋白质其含氮量含氮量也不同也不同，蛋白质的量与氮含量，蛋白质的量与氮含量的关系用的关系用蛋白质系数蛋白质系数表示：表示：蛋白质系数蛋白质系数每份氮素相当于的蛋白质的份数。每份氮素相当于的蛋白质的份数。一般一般蛋白质含氮为蛋白质含氮为16%16%，所以，所以1 1份氮素相当于份氮素相当于6.256.25份蛋白质。份蛋白质。此数值（此数值（6.256.25）称为蛋白质系数）称为蛋白质系数，用，

6、用F F表示。表示。不同种类不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为鸡蛋等为6.256.25，花生为，花生为5.465.46，大米为，大米为5.955.95，大豆及其，大豆及其制品为制品为5.715.71，小麦粉为，小麦粉为5.705.70，牛乳及其制品为，牛乳及其制品为6.386.38。（4 4）蛋白质系数）蛋白质系数三鹿奶粉相关荣誉三鹿奶粉相关荣誉 中国名牌产品，中国驰名商标，国家免检中国名牌产品，中国驰名商标，国家免检产品，绿色食品，中国食品工业百强，农产品，绿色食品，中国食品工业百强，农业产业化国家重点龙头企业，中国最

7、具价业产业化国家重点龙头企业，中国最具价值的品牌，国家第一批卫生安全食品值的品牌，国家第一批卫生安全食品。石家庄三鹿集团股份有限公司石家庄三鹿集团股份有限公司2008年年9月月11日晚则发布产品召回声明称，经公司自日晚则发布产品召回声明称，经公司自检发现检发现2008年年8月月6日前出厂的部分批次三日前出厂的部分批次三鹿鹿婴幼儿奶粉婴幼儿奶粉受到三聚氰胺的污染，市场上受到三聚氰胺的污染，市场上大约有大约有700吨。吨。三聚氰胺三聚氰胺(melamine)是一种有机含氮杂环化合物，学名是一种有机含氮杂环化合物，学名1,3,5-三嗪三嗪-2,4,6-三胺，三胺，或称为或称为2,4,6-三氨基三氨基

8、1,3,5-三嗪，简称三胺、蜜胺、氰尿三嗪，简称三胺、蜜胺、氰尿酰胺，是一种重要的化工原料，主要用途是与醛缩合，生酰胺，是一种重要的化工原料，主要用途是与醛缩合，生成三聚氰胺成三聚氰胺-甲醛树脂，生产塑料，这种塑料不易着火，耐甲醛树脂，生产塑料，这种塑料不易着火，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀，有良好的绝缘水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀，有良好的绝缘性能和机械强度，是木材、涂料、造纸、纺织、皮革、电性能和机械强度，是木材、涂料、造纸、纺织、皮革、电器等不可缺少的原料。它还可以用来做胶水和阻燃剂，部器等不可缺少的原料。它还可以用来做胶水和阻燃剂，部分亚洲国家，也被用来制造化肥。分亚

9、洲国家，也被用来制造化肥。三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66），加之其生产工艺简单、成本很低，），加之其生产工艺简单、成本很低，给了掺假、造假者极大地利益驱动，有人给了掺假、造假者极大地利益驱动，有人估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的蛋白原料的1/5。所以所以“增加增加”产品的表观产品的表观蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因，蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因，三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什没有什么气味

10、和味道，么气味和味道，掺杂后不易被发现等也成掺杂后不易被发现等也成了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因。了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因。化学性质化学性质三聚氰胺呈弱碱性（三聚氰胺呈弱碱性（pKa=8），可与多种），可与多种酸反应生成三聚氰胺盐。遇强酸或强碱水酸反应生成三聚氰胺盐。遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。毒性：毒性：以前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致以前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于

11、死量大于3克克/公斤体重。据公斤体重。据1945年的一个实验报道：年的一个实验报道：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。进一步诱发膀胱癌。2007年中国徐州一家出口美国猫狗食物的年中国徐州一家出口美国猫狗食物的企业在宠物食品中添加三聚氰胺来冒充蛋企业在宠物食品中添加三聚氰胺来冒充蛋白质导致中美关系轩然大波白质导致中美关系轩然大波。宠物食品污染事件的初步

12、调查结果认为：掺宠物食品污染事件的初步调查结果认为：掺杂了杂了6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因，为上述毒性轻微的食品导致中毒的原因，为上述毒性轻微的结论画上了问号。结论画上了问号。导致美国大量宠物死亡，被导致美国大量宠物死亡，被FDA彻底封杀。彻底封杀。（FDA，美国食品药品管理局）。，美国食品药品管理局）。三聚氰胺的分子式是三聚氰胺的分子式是C3H6N6，即氮含量为，即氮含量为2/3，按，按GB/T 5009.5-2003，食品中蛋白，食品中蛋白质的测定（凯氏定氮法），乳制品的蛋白质的测定（凯氏定氮法），乳制品的蛋白氮换算系数为氮换算系数为6.3

13、8，即，即1的蛋白氮含量，的蛋白氮含量，折算蛋白质含量为折算蛋白质含量为6.38，这样加入，这样加入3三聚氰胺就蛋白含量三聚氰胺就蛋白含量“达标达标”了。了。（5 5）蛋白质主要测定方法有：）蛋白质主要测定方法有：o紫外分光光度法紫外分光光度法o水杨酸比色法水杨酸比色法o折光法折光法o旋光法旋光法o近红外光谱法近红外光谱法 目前蛋白质测定最常用的方法是目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法是通过测出样品中的是通过测出样品中的总含氮量总含氮量再乘以相应的蛋白再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量质系数而求出蛋白质的含量此法的结果称为此法的结果称为粗蛋白质粗蛋白质含

14、量含量：由于样品中含有由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物合物凯氏定氮法凯氏定氮法是是测定总有机氮量较为准确测定总有机氮量较为准确、操作操作较为简单的方法之一，可用于所较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食有动、植物食品品的分析及各种加工食品的分析及各种加工食品的分析的分析，可同时测定，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析分析方法，至今仍方法，至今仍 被作为被作为标准检验方法标准检验方法

15、。凯氏定氮法凯氏定氮法：常量法常量法、微量法及改良凯氏定氮微量法及改良凯氏定氮法法 原理原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的逸出，而样品中的有机氮转化为氨有机氮转化为氨与硫酸结合与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括包括消化、蒸馏、吸收、滴定消化、蒸馏、吸收

16、、滴定四个步骤。四个步骤。2 NH2 NH2 2-(CH-(CH2 2)2 2-COOH+13H-COOH+13H2 2SOSO4 4(NH(NH4 4)2 2 SOSO4 4+6CO+6CO2 2+12SO12SO2 2+16H+16H2 2O O 浓硫酸的作用浓硫酸的作用：脱水作用脱水作用使有机物脱水并碳化为使有机物脱水并碳化为C C、H H、N N 氧化作用氧化作用将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫酸则被还原成二氧化硫 2H2H2 2SOSO4 4 C C 2SO2SO2 2 2H2H2 2O O COCO2 2 二氧化硫使氮还原

17、为氨，本身则被氧化为三氧化二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。硫，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。v加入硫酸钾的作用是加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点提高溶液沸点而加而加快快有有机物的分解机物的分解（3383380 0C C 4004000 0C C）K K2 2SOSO4 4+H+H2 2SOSO4 4=2KHSO=2KHSO4 4 2KHSO 2KHSO4 4=K=K2 2SOSO4 4+H+H2 2O+SOO+SO3 3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分

18、解而造过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：成损失：（NHNH4 4）2 2SOSO4 4=NH=NH3 3+(NH+(NH4 4)HSO)HSO4 4 2(NH 2(NH4 4)HSO)HSO4 4=2NH=2NH3 3+2SO+2SO3 3+2H+2H2 2O O 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。提高沸点，但效果不如硫酸钾。v加入硫酸铜的作用加入硫酸铜的作用 催化作用催化作用：加速有机物的氧化分解：加速有机物的氧化分解 C C 2CuSO4 Cu2CuSO4 Cu2 2SOSO4 4 SOSO2 2 CO

19、CO2 2 Cu Cu2 2SOSO4 4 2H2H2 2SOSO4 4 2CuSO 2CuSO4 4 2H2H2 2O O SOSO2 2 此反应不断进行，待有机物被消化完此反应不断进行，待有机物被消化完后，后，不再有硫不再有硫酸亚铜酸亚铜（褐色）（褐色）生成，溶液呈现清澈生成，溶液呈现清澈的蓝的蓝绿色绿色。消化完全指示消化完全指示：蓝绿色；：蓝绿色；在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气性，加热蒸馏，即可释放出氨气 (NH(NH4 4)2 2 SOSO4 4+2NaOH+2NaOH 2NH 2NH3 3+Na+Na2

20、 2SOSO4 4+2H+2H2 2O O 蒸馏时碱性反应完全指示蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生：变深蓝色或产生黑色沉淀黑色沉淀 蒸馏蒸馏 消化液消化液+40%氢氧化钠加热氢氧化钠加热蒸馏，放出氨蒸馏，放出氨气。气。滴定滴定 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定,蓝绿色蓝绿色灰红色灰红色讨论：讨论：1 1、实验中用到哪些试剂？作用是什么？、实验中用到哪些试剂？作用是什么？此法可应用于各类食品中蛋白质含此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定量测定仪器、试剂仪器、试剂:500mL 500mL凯氏烧瓶、凯氏定氮装置凯氏烧瓶、凯氏定氮装置 消化用：消化用：浓硫酸浓

21、硫酸 硫酸钾硫酸钾 硫酸铜硫酸铜蒸馏用：蒸馏用：40%40%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液吸收用：吸收用：4%4%硼酸硼酸滴定用：滴定用：HClHCl标准溶液标准溶液 0.1%0.1%甲基红乙醇溶液与甲基红乙醇溶液与0.1%0.1%溴甲酚绿乙醇溴甲酚绿乙醇溶液混合指示剂溶液混合指示剂 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法操作步骤操作步骤 样品消化样品消化 蒸馏蒸馏 吸收吸收 滴定滴定 样品消化样品消化 :准确称取一定量的样品至干燥洁净的准确称取一定量的样品至干燥洁净的500mL500mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.5g0.5g（1g1g）、硫酸钾）、硫酸钾10g10g（3g)3g)和浓硫

22、酸和浓硫酸20mL20mL、玻璃珠数粒、玻璃珠数粒轻轻摇匀，以轻轻摇匀，以4545 斜斜支于石棉网上支于石棉网上用电炉以小火加热用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电或先烧瓶放在距电炉较远处炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后加加大火力大火力(或将烧瓶放在电炉上或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸，保持瓶内液体微沸至至液体变蓝绿色透明后液体变蓝绿色透明后继续加热微沸继续加热微沸30min30min关闭电炉，关闭电炉，取下烧瓶、冷却取下烧瓶、冷却转移至转移至100mL100mL容量瓶中，加水定容。容量瓶中，加水定容。v注意问题：注意问题：加入样品不要沾附在

23、凯氏烧瓶瓶颈；加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈；消化开始时不要用强火，要控制好热源，并消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫；化过程中产生大量泡沫；消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。用试剂溶

24、液应用无氨蒸馏水配制。v 思考：思考：1 1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？变化？2 2、如何判断消化的终点？、如何判断消化的终点？蒸馏与吸收：蒸馏与吸收：v按图安装好按图安装好微量定微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至瓶内装水至2/32/3容积处，加容积处，加甲基橙甲基橙指示剂数滴及指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈硫酸数毫升，以保持水呈酸性酸性，加入数粒玻璃，加入数粒玻璃珠珠。v在在吸收瓶中吸收瓶中加入加入1010m mL L 40g/L40g/L硼酸及硼酸及2 2滴混合指示滴混合指示剂，将冷凝管下端

25、插入液面以下。剂，将冷凝管下端插入液面以下。v准确吸取消化液准确吸取消化液10mL10mL于反应管内，经漏斗再加于反应管内，经漏斗再加入入10mL10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内加热煮沸水蒸气发生瓶内的水的水进行蒸馏。进行蒸馏。v指示剂变绿色后继续蒸馏指示剂变绿色后继续蒸馏10 min10 min，将冷凝管尖，将冷凝管尖端提离液面继续蒸端提离液面继续蒸1min1minv 蒸馏、吸收蒸馏、吸收注意问题：注意问题：（1 1）整套装置不能漏气，要注意各蒸汽控制夹子）整套装置不能漏气，要注意各蒸汽

26、控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。（2 2）在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸）在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。性以防氨蒸出。（3 3）加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生黑）加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。出。（4 4）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏；吸收液温度不应超过蒸馏；吸收液温度不应超过4040，若超过时可，若超过时可置于冷水浴中使用；蒸馏完毕后，应先将置于冷水浴中使用；蒸

27、馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸冷凝管下端提离液面，再蒸1 1分钟，分钟，将附着在尖端将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，后关闭电源，绝绝不能先关闭电源，否则吸收液将发不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。生倒吸。（5 5）在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反）在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管应管(倒吸法，在吸收瓶中加入蒸馏水，其余同测倒吸法，在吸收瓶中加入蒸馏水，其余同测定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即移开电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再

28、倒吸移开电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中，打开夹子，即可放入汽水分离管或蒸汽发生器中，打开夹子，即可放出废水。出废水。（6 6）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。滴定滴定 将接受瓶内的硼酸液用将接受瓶内的硼酸液用0.010.01mol/Lmol/L盐酸标准溶液滴定盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。开始操作完全相同）。(4)(4)结果计算结果计算 式中式中 WW蛋白质

29、的质量分数，蛋白质的质量分数，%；c c盐酸标准盐酸标准溶溶液的浓度，液的浓度，mol/Lmol/L；V V1 1空白滴定消耗标准液量，空白滴定消耗标准液量，mLmL；V V2 2试剂滴定消耗标准液量，试剂滴定消耗标准液量，mLmL；m m样品质量，样品质量，g g；0.014 0.014氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/mmolg/mmol；F F蛋白质系数。蛋白质系数。10010010014.0)(12mFVVcWv思考：思考：1 1、为什么在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和指、为什么在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和指示剂甲基橙？示剂甲基橙？2 2、为什么在每次测定前及两次测定之间，、为什么在每次测定

30、前及两次测定之间，均要洗涤反应管？如何洗涤？均要洗涤反应管？如何洗涤？常量法常量法 消化：同消化：同“微量法微量法”蒸馏与吸收：蒸馏与吸收：与微量法的不同？与微量法的不同？滴定：用盐酸标准溶液滴定：用盐酸标准溶液0.1mol/L0.1mol/L，其余同，其余同“微微量法量法”。3.3.计算：与微量法的不同？计算：与微量法的不同？4.4.注意：同注意：同“微量法微量法”分光光度法测定蛋白质含量分光光度法测定蛋白质含量v原理：试样与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋原理：试样与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。在白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。在pH=4.8

31、pH=4.8的乙酸的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮乙酸钠缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的化合物。在波长和甲醛反应生成黄色的化合物。在波长400nm400nm处测处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以蛋白定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以蛋白质系数，即为蛋白质含量。质系数，即为蛋白质含量。v氨氮标准溶液（氨氮标准溶液（1.0g/L1.0g/L）：精密称取经）：精密称取经105105干燥干燥的硫酸铵的硫酸铵0.4720g0.4720g，用水溶解并定容至，用水溶解并定容至100mL,100mL,临临用时用水稀释至用时用水稀释至0.1g/L0.1g/L双缩脲法：双缩脲法：双缩

32、脲的性质：当脲被小心地加热至双缩脲的性质：当脲被小心地加热至 150150160160时，时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应应称为双缩脲反应测定原理：蛋白质分子中肽键（测定原理：蛋白质分子中肽键（CONHCONH）与双缩）与双缩脲结构相似，也能呈现此反应而生成紫红色配合物，脲结构相似，也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，用吸在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，用吸收光度法来测定蛋白

33、质含量，最大吸收波长为收光度法来测定蛋白质含量，最大吸收波长为560nm560nm。特点：简单快速，特点：简单快速，灵敏度低灵敏度低，常用于生物化学领域。，常用于生物化学领域。双缩脲法双缩脲法1.原理原理脲（尿素）脲（尿素）NH2CONH2 加热至加热至150160时，两分时，两分子缩和成双缩脲。子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络和物，双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络和物，此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键（蛋白质分子中含有肽键（CONH），与双缩），与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条脲结构相似。

34、在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 +NH3NH2CONH2+NH2CONH2注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化2.方法特点及应用范围方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。豆类、油料、米谷等

35、作物种子及肉类等样品测定。3.主要仪器：主要仪器：分光光度计，离心机（分光光度计，离心机（4000 r/m in）4.试剂：试剂：(1)碱性硫酸铜溶液碱性硫酸铜溶液 o甘油作为稳定剂：取甘油作为稳定剂：取10ml10mol/L KOH溶液，溶液，3.0ml甘油加到甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时慢慢水中，激烈搅拌，同时慢慢加入加入50ml4%CuSO4。o酒石酸钠作稳定剂，吸酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10mol/L KOH溶溶液和液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，水中，激烈搅拌，同时慢慢加入激烈搅拌，同时慢慢加入4%CuSO4液液40ml。配制以上两

36、种溶液、试剂，必须澄清，无氢配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。氧化铜生成，否则重配。(2)四氯化碳四氯化碳5操作方法：标准曲线绘制操作方法：标准曲线绘制准确称准确称0.6g样品样品使用试剂使用试剂准确称准确称0.5g样品样品使用试剂使用试剂假如用试剂假如用试剂（1）标准曲线绘制）标准曲线绘制 按凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品为按凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品为标样，根据样品中蛋白质含量，取离心澄清液标样，根据样品中蛋白质含量，取离心澄清液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于于10ml容量瓶中容量瓶中分分别加水定容，在别加水定容，在560nm波长下测定其吸光度

37、。波长下测定其吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以上述吸光度以蛋白质含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。为纵坐标绘制标准曲线。（2）准确称样）准确称样0.5g于于80ml离心管离心管加加1mlClC4混合混合加加50ml酒石酸钾钠稳定剂酒石酸钾钠稳定剂盖上盖子离心盖上盖子离心10min（4000转转/分）分）放置放置1小小时时吸混合液吸混合液15ml于于20ml离心管中离心管中离心离心到完全透明到完全透明取上清夜取上清夜5ml于于10ml容量瓶容量瓶加水定容加水定容于于560nm处测定吸光度，从标准曲处测定吸光度，从标准曲线上查出蛋白质含量。线上查出蛋白质含量。4 计算：蛋白质%=（C

38、/W）100 C-从标准曲线上查得得蛋白质含量（mg）W-测定样液时相当于样品重量（mg）三紫外吸收法三紫外吸收法 1 1原理：利用蛋白质的特有基团，原理：利用蛋白质的特有基团，R R（NH NHCHCHCO-CO-）在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在在280nm下，光吸收与蛋白质浓度（下，光吸收与蛋白质浓度（38mg/ml）成直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光成直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法分析的标准样品，度，并参照事先用凯氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。从标准曲线查出蛋白质的含

39、量。2 2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。析领域应用不广泛。3 3主要仪器：主要仪器：紫外分光光度计紫外分光光度计 离心机（离心机（3000 3000 5000 r/min 5000 r/min）4 4操作：操作：（1）标准曲线的绘制：准确称取样品）标准曲线的绘制：准确称取样品.2.00g，置于，置于50ml烧烧瓶中，加入瓶中，加入0.1mol/l柠檬酸水溶液柠檬酸水溶液30ml，搅拌，搅拌30分钟使其充分溶分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以每分钟解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，

40、以每分钟30005000转的转的速度离心速度离心10分钟，分别吸取上清夜分钟，分别吸取上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于于6个个10ml容量瓶钟，每个容量瓶各加入容量瓶钟，每个容量瓶各加入8mol/l脲的氢氧化脲的氢氧化钠溶液至标线，充分摇钠溶液至标线，充分摇2分钟（如果混浊再次离心），取透明液于分钟（如果混浊再次离心），取透明液于比色皿中，在比色皿中，在280nm下测定其吸光度。（做参比值）下测定其吸光度。（做参比值）以事先用凯氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量为横以事先用凯氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量为横坐标，上述的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。坐标，上述的吸光度

41、为纵坐标，绘制标准曲线。（2）样品测定）样品测定 准确称取试样准确称取试样1.00g于于50ml烧杯中烧杯中加加0.1mol/l柠柠檬酸溶液檬酸溶液30ml搅拌搅拌10分钟分钟四层纱布过滤到离心管中四层纱布过滤到离心管中用用8mol/L脲的脲的NaOH溶液定容，摇匀后于溶液定容，摇匀后于280nm下测吸下测吸光度，从标准曲线上查出蛋白质的含量。光度，从标准曲线上查出蛋白质的含量。计算：计算：蛋白质蛋白质=（C/W）100 C-从标准曲线上查得的蛋白质含量（从标准曲线上查得的蛋白质含量（mg）W-测定样品溶液相当于样品量（测定样品溶液相当于样品量（mg）说明：说明：a.此法运用于糕点，牛乳和可溶

42、性蛋白质样品，此法运用于糕点，牛乳和可溶性蛋白质样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。测定糕点时，应把表皮颜色去掉。b.温度对蛋白质水解有温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在影响，操作温度应控制在2030。染料结合法：染料结合法：原理：原理：在特定的条件下，蛋白质可与某些染料在特定的条件下，蛋白质可与某些染料定量的反应生成沉淀，用分光光度计测定沉淀定量的反应生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完全后剩余的染料量可计算出反应消耗的反应完全后剩余的染料量可计算出反应消耗的染料量，进而求得样品中蛋白质的含量。染料量，进而求得样品中蛋白质的含量。适用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力饮料等食适用于牛乳、冰淇

43、淋、乳酪、巧克力饮料等食品。品。四四.水扬酸比色法：水扬酸比色法：1.原理：原理：样品中的蛋白质经样品中的蛋白质经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有蓝一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有蓝色的化合物，可以在波长色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。氮量，计算蛋白质含量。2.方法方法 （）标准曲线的绘制（）标准曲线的绘制 取取6个个25ml容量瓶编号容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6 分别加空白酸液分别加空白酸液 2ml 分别加磷酸盐缓冲液分别加磷酸

44、盐缓冲液 5ml 稀释至总体体积至稀释至总体体积至 15ml 分别加水扬酸钠分别加水扬酸钠 5ml 37C水浴水浴 15分钟分钟 加入次氯酸钠加入次氯酸钠 2.5ml 37C水浴水浴 15分钟分钟 取出加水至标线，于取出加水至标线，于660nm下进行比色测定，绘标准下进行比色测定，绘标准曲线曲线（2）样品处理：）样品处理：准确称样准确称样0.201.00g于于K氏瓶中氏瓶中加加15mlH2SO4和和5g催化催化剂剂电炉上加热到沸腾后电炉上加热到沸腾后加大火力消化加大火力消化直到出现暗绿色时直到出现暗绿色时摇动瓶子摇动瓶子K氏瓶全部消化后氏瓶全部消化后冷却冷却加水至加水至250ml容量瓶。容量瓶

45、。（3）样品测定：）样品测定：准确吸取上述消化溶液准确吸取上述消化溶液10ml于于100ml容量瓶中容量瓶中定容定容准确吸准确吸2ml于于25ml容量瓶中容量瓶中加加5ml磷酸缓冲液磷酸缓冲液以下操作以下操作与标准曲线绘制的步骤相同与标准曲线绘制的步骤相同 并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。出其含氮量。（4）计算）计算 CF 含氮含氮%=-100 W10001000 C-从标准曲线中查出测定样液的含氮量（从标准曲线中查出测定样液的含氮量（g）F-样品溶液的稀释倍数样品溶液的稀释倍数 W-样品重量（样品重量（g）蛋白质

46、蛋白质%=总氮总氮%K（K可为可为6.25，也可查），也可查）氨基酸的测定氨基酸的测定o双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法o电位滴定法电位滴定法o茚三酮显色法茚三酮显色法o氨基酸的分离及测定氨基酸的分离及测定 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中的物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中的2020种，种，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈在体内缺乏而导

47、致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。代谢作用。氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故称为氨基酸态氮。称为氨基酸态氮。氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量。氨基酸的总量。氨基酸态氮的测定氨基酸态氮的测定双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法电位电位滴定法滴定法双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法原理原理 氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH

48、-COOH基和碱性的基和碱性的-NH-NH2 2基。基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，入甲醛溶液时，-NH2-NH2基与甲醛结合，从而使其碱基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOHCOOH基，用间接的方法测定氨基酸的总量。基，用间接的方法测定氨基酸的总量。方法特点及应用方法特点及应用 此法简单易行、快速方便。脯氨酸与甲醛此法简单易行、快速方便。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高；酪作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高；酪氨酸含有羟基，滴定时会消

49、耗碱液使结果偏高；氨酸含有羟基，滴定时会消耗碱液使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果高。果高。特别适合浅色样品的测定特别适合浅色样品的测定试剂试剂 40%40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将氢氧化钠将40%40%甲醛中和至淡蓝色。甲醛中和至淡蓝色。0.1%0.1%百里酚酞乙醇溶液百里酚酞乙醇溶液 0.1%0.1%中性红中性红50%50%乙醇溶液乙醇溶液 0.1 mol/L0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液氢氧化钠标准溶液操作方法操作方法预处理：预处理：移取含氨基酸约移取含氨基酸约202

50、030mg30mg的样品溶的样品溶液液2 2份份中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量）：它游离酸的含量）：其中其中1 1份加入份加入3 3滴中性红滴中性红指示剂，用指示剂，用0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为至由红变为 琥珀琥珀 色为终点，记录色为终点，记录V1V1滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）：酸和游离酸的总含量）：另另1 1份加入份加入3 3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL20mL，摇匀，静置，摇