膜片钳实验与技术课件.ppt
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1、膜片钳技术讲座 在膜片钳技术及应用(2003)一书的序言中写道:通常,一篇非常专业的科技论文公开发表后,若被其他的论文引用数次,其作者就会感到欣慰;假如被别的作者引用十次以上,就可称得上是一篇好论文;要是有幸被引用几十上百次,甚至几百次,那它无疑是一篇高质量杰作,通常发表在权威的专业期刊或者是著名的科学杂志上,如“Nature”,“Science”,“Cell”和“Neuron”等。然而,你是否知道?有一篇论文,它的作者当时还不太有名,刊登的杂志也不算顶级,可是论文发表20年来,已神话般地被世界各地的科技工作者引用了一万二千余次,遍及生物医学的众多领域,而且近年来还在以平均每年约一千多篇的速度
2、继续被引用,它就是由Hamill,Marty,Neher,Sakmann和Sigworth等五人于1981年发表在欧洲生理学杂志上的著名论文。在此之前五年,身为德国科学家的Neher和Sakmann共同发明了膜片钳技术(1976),并于15年后共同荣获1991年诺贝尔 生理学或医学奖。目目 录录 一、离子通道的概念一、离子通道的概念 二、离子通道的分子结构二、离子通道的分子结构 三、离子通道的分类三、离子通道的分类 四、离子通道的研究技术四、离子通道的研究技术 五、膜片钳实验方法五、膜片钳实验方法 六、膜片钳改良模式及其它研究方法六、膜片钳改良模式及其它研究方法一、离子通道的概念一、离子通道的
3、概念 离子通道(ion channels)是镶嵌在细胞膜脂质双分子层上的一种特殊整合蛋白,在特定情况下,形成具有高度选择性的亲水性孔道,允许适当大小和电荷的离子以被动转运的方式通过。离子通道具有两大共同特征,即离子选择性及门控特性。选择性包括通道对离子大小的选择性及电荷选择性,如安静时神经细胞膜离子通道对K+的通透性比Na+大100倍,而神经兴奋时,对Na+通透性又比K+大1020倍。通道闸门的开启和关闭过程称为门控门控(gating)。通道可表现为三种状态,即备用、激活及失活状态。二、离子通道的分子结构二、离子通道的分子结构 随着生物物理学和分子生物学的迅速发展,新的研究技术的应用,特别是膜
4、片钳片技术与分子克隆、基因突变和异体表达等技术的结合,使离子通道的研究迅速进入到分子、亚分子水平,人们已开始有能力从分子水平来确定通道的分子结构和解释离子通道的孔道特性。电压门控离子通道的基本结构 经纯化、克隆和测定表明,离子通道蛋白是由多个亚基构成的复合体。电压门控离子通道由、等亚基构成,但不同的离子通道的组成略有差异,如钠通道由、1、2和3、4亚基组成,钙通道由1、2、和亚基组成,钾通道由和亚基组成等。在各亚基中,亚基是构成离子通道的主要功能单位,而其它亚基则只起调节作用。亚基是一条跨膜多肽,由1800 2000个氨基酸组成。它包括四个跨膜结构域(),每个结构域含有6个螺旋片段(S1S6)
5、,除S4为亲水性跨膜螺旋片段外,其余5个均为疏水性跨膜螺旋片段。位于S5和S6间的一段氨基酸序列部分贯穿膜内,是形成亲水性孔道而使离子选择性通过的部分称为孔道区(pore region)或P区,四个结构域围绕一个中心对称排列,P区在内组成孔道内壁。S4肽段含有一些带正电荷的氨基酸残基(如精、赖氨酸),对膜电位的变化敏感,起电压感受器的作用。当膜去极化时,每一个功能区的S4肽段做螺旋运动而使正电荷移出产生微弱而短暂的门控电流,导致通道构象变化。当四个结构域S4肽段均发生这种构象变化时,则通道便处于激活开放状态,因此,S4肽段又称为激活闸门(activation gate,m闸门)在通道开放后,很
6、快结构域的S6与功能区的S1之间的肽链构成失活闸门(inactivation gate,h闸门),形成一“活瓣”,将通道内口阻塞,调控通道的失活过程。化学门控离子通道的基本结构 当各种化学物质与化学门控离子通道相应部位结合后,会导致通道蛋白发生构型变化,引起通道开放,产生离子电流。体内这种离子通道的种类很多,主要包括各种神经递质门控离子通道、ATP敏感钾通道和钙依赖性钾通道等。神经递质门控离子通道又称为离子通道受体,主要有乙酰胆碱门控离子通道、GABA门控离子通道及谷氨酸门控离了通道三大类。乙酰胆碱门控离子通道 由12 五个亚基组成,呈五边形排列。每个亚基有4个跨膜区段即M14,由五个亚基的M
7、2共同构成孔道的内壁。在1和2亚基N端的细胞外部分各有一个ACh结合位点,当两个ACh分子与亚基结合后,便引起通道蛋白的构象变化和通道开放,主要引起Na+内流增多。三、离子通道的分类三、离子通道的分类非门控离子通道 门控离子通道 电压门控性通道化学门控性通道机械门控性通道 1、非门控性离子通道 有些离子通道始终处于开放状态,离子可随时进出细胞,并不受外界信号的明显影响,这些通道称为非门控离子通道。如神经和肌肉细胞静息电位就是由于细胞膜上的离子通道允许K+自由进出细胞,而引起的K+电化学平衡电位,此种K+通道即属于非门控性离子通道。2、电压门控离子通道 电压门控离子通道(voltage-gate
8、d ion channels)又称电压依赖性离子通道,这一类通道的开启或关闭受膜电位的变化决定,具有电压依赖性和时间依赖性。电压门控离子通道一般以最容易通过的离子命名,如钠离子通道、钙离子通道及钾离子通道等。电压门控钠离子通道 钠离子通道(sodium channels,简称钠通道),是选择性地容许Na+跨膜通过的离子通道。根据其对钠通道阻滞剂河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)和-食鱼螺毒素(-conotoxin,-CTX)的敏感性不同分为神经类、骨骼肌类和心肌类钠通道三类。电压门控钙离子通道 钙离子通道(calcium channels,简称钙通道)是选择性容许Ca2+跨膜通过的离
9、子通道。根据肌细胞和神经元电压门控离子通道对膜电位变化的敏感性,将神经元质膜电压门控钙离子通道分为T、L及N三种类型,后来应用不同的毒素阻断钙电流的某种特定的成分,在神经元又增加了P、Q和R型,共6型。电压门控钾离子通道 钾离子通道(potassium channels,简称钾通道)是广泛存在、种类最多、最为复杂的一大类离子通道,仅电压门控钾通道就已克隆出几十种亚型,根据其电流动力学特点可分为延迟外向整流钾通道、瞬时外向钾通道和内向整流钾通道三类。3、化学门控离子通道 化学门控离子通道(chemically gated ion channels)又称配体门控通道(ligand gated ch
10、annels)。这一类通道的门控行为主要受其相应配体的控制,配体是包括神经递质、激素等各种激动剂和阻滞剂在内的多种化学因素。当激动剂与化学门控离子通道结合后,会引起通道蛋白构型变化,导致通道开放,产生离子电流。4、机械门控离子通道 机械门控离子通道(mechanically gated ion channels)是由机械牵拉激活的离子通道,主要见于触觉和听觉感受器,如声波传入内耳后,引起内耳毛细胞顶端纤毛发生弯曲或偏斜,从而使毛细胞顶端机械门控通道开放,阳离子内流产生听觉的感受电位。5、其它门控离子通道 除上述离子通道外,尚发现具有其它门控特性的离子通道存在,如细胞容积敏感的钾通道(Kvo l
11、)在细胞肿胀时通道开放;Na+激活钾通道(KNa)对电压、细胞内ATP浓度及细胞内钙均不敏感,只有细胞内Na+浓度升高到20mmol/L以上时开放;存在于多种肌细胞的静息活化钙通道,在没有电压、化学或机械刺激时,参与静息钙内流,调制静息时的细胞内钙浓度。四、离子通道的研究技术四、离子通道的研究技术1、电压钳技术 电压钳技术是1949年Cole及Marmont设计的,后经Hodgkin、Huxley 和Katz等加以改进,并成功地应用于枪乌贼巨轴突动作电位期间离子电流的研究。他们直接测定了膜电流并分析了电流的离子成分,推算出动作电位期间钠电导和钾电导的变化,其基本概念至今仍被沿用。鉴于Hodgk
12、in、Huxley 和Eccles 对通道研究的突出贡献,获得1963年诺贝尔医学或生理学奖。A.L.Hodgkin 19141998A.F.Huxley 1917 电压钳技术是通过一个反馈电路使膜电位保持在指定的水平,当离子通道开放产生跨膜电流,导致膜电位改变时,可通过反馈电路经微电极向胞内注入电流,补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流,使膜通透性发生改变时膜电位保持不变,此时注入电流的变化就可反应膜电导或膜电流的改变。电压钳技术工作原理如示意图:2 2、膜片钳技术、膜片钳技术 1976年Neher和Sakmann完成电极与膜之间50M的封接,首次记录到去神经蛙肌纤维膜上的单通道电流,为
13、证实生物膜离子单通道是以全或无规律、随机开放关闭的假说提供了有力依据。但是,当时实验记录的背景噪声较大。1980年,Neher利用负压吸引实现了G封接,背景噪声显著减低。1991年膜片钳技术的创始人Neher和Sakmann荣获诺贝尔医学或生理学奖。Patch clamp Erwin Neher Bert Sakmann 1944 1942 膜片钳技术是用尖端直径12m的玻璃微电极吸管与经蛋白酶处理干净的细胞膜接触,通过2030cm H2O的负压吸引造成电极尖端与细胞膜形成高阻封接(10100G),使电极尖端下的小块膜片与膜的其它部分在电学上绝缘,并在此基础上固定膜片电位,监测几个m2膜片上1
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