基因克隆和表达的载体课件.ppt

1、2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 1课程要求课程要求v通过本课程的学习，通过本课程的学习，掌握基因工程的掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技术等。一些基本原理和基本操作技术等。v总成绩平时（总成绩平时（2020）实验（）实验（3030）考试（考试（5050）v平时成绩平时成绩(考查迟到、早退，课堂提问、考查迟到、早退，课堂提问、讨论、遵守课堂纪律等方面讨论、遵守课堂纪律等方面)2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 2教材和参考文献教材和参考文献1.楼士林等，基因工程，科学出版社，楼士林等，基因工程，科学出

2、版社，20022.吴乃虎，基因工程原理（第二版上、下册），科学出版吴乃虎，基因工程原理（第二版上、下册），科学出版社，社，19983.张惠展编著，张惠展编著，1999年出版，年出版，基因工程概论基因工程概论，华东理，华东理工大学出版社。工大学出版社。4.Watson,J.D et al.Recombinant DNA,W.H.Freeman and Company,New York,2ed,19925.Robert F.Weaver,Molecular Biology,科学出版社科学出版社,2000（影印版）（影印版）2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slid

3、e 3本课程内容本课程内容v第一章第一章 绪论绪论v第二章第二章 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶v第三章第三章 基因工程的载体基因工程的载体v第四章第四章 目的基因的制备目的基因的制备v第五章第五章 目的基因导入和重组子的筛选目的基因导入和重组子的筛选v第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达v第七章第七章 基因操作的基本技术基因操作的基本技术v第八章第八章 植物基因工程及应用植物基因工程及应用v第九章第九章 动物基因工程及应用动物基因工程及应用v第十章第十章 医学基因工程及应用医学基因工程及应用2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 4第三章第三章

4、 基因工程的载体基因工程的载体3.1 载体的功能及其特征载体的功能及其特征3.2 质粒克隆载体质粒克隆载体3.3 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体3.4 酵母载体酵母载体3.5 人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 53.1 载体的功能及其特征载体的功能及其特征v载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。v载体：指能够运载外源指能够运载外源DNA片段（目的基因）片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不片段在受体细胞中

5、得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。分子。v载体的功能载体的功能:v1.1.运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞2.2.为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力3.3.为外源基因的扩增或表达提供条件为外源基因的扩增或表达提供条件 作为工程载体必备的条件作为工程载体必备的条件v具有多个单一的限制性内切酶酶切位点具有多个单一的限制性内切酶酶切位点v有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体染色体DNA上随染色体上随染色体DNA的复制而同步复制。的复制

6、而同步复制。v具有筛选转化子的选择性标记基因具有筛选转化子的选择性标记基因v安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。受体细胞以外的其它生物细胞中。v分子量小，拷贝数多。分子量小，拷贝数多。v携带外源基因的幅度宽携带外源基因的幅度宽2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 62022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 7自主复制型载体和附加载体的扩增方式 载体的类型载体的类型v应用范围应用范围：克隆载体、表达载体。：克隆载体、表达载体。v应用对象

7、应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。物和动物）、穿梭载体。v构建来源构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒质粒DNA与病毒或噬菌体与病毒或噬菌体DNA组成的载体、组成的载体、质粒质粒DNA与染色体与染色体DNA片段组成的载体。片段组成的载体。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 8克隆载体克隆载体(cloning vector)用于在受体细胞中进行目的用于在受体细胞中进行目的基因扩增基因扩增的的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝载体。一般具有较低的分子量、较高的

8、拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组重组构建构建。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 9表达载体表达载体(expression vector)使使目的基因目的基因在宿主细胞在宿主细胞中得以中得以表达表达的的载体。可将重组体载体。可将重组体DNA导入适合的受体细导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译翻译。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 10

9、穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)v又称又称双功能载体双功能载体(bifunctional vector)。能在两种不同。能在两种不同的生物体内复制的载体。的生物体内复制的载体。v同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它即能在，它即能在原原核细胞中核细胞中扩增扩增又能在又能在真核细胞中复制和真核细胞中复制和表达表达。v主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物是将载体和待克

10、隆的真核生物DNA片段先在细菌中克片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。达效率。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 11病毒载体病毒载体(virus vector)常用的动物病毒表达载体可分为两大类：常用的动物病毒表达载体可分为两大类：v整合型（整合型（integrated）载体）载体:即外源基因通过这种病毒即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是因组的复制而

11、扩增。这类载体的代表是 SV40PSV系系列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。等。v游离型游离型(transient)或称病毒颗粒型载体或称病毒颗粒型载体:这类载体携带这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒毒载体从构建来源载体从构建来源分分v质粒载体质粒载体v病毒或噬菌体载体病毒

12、或噬菌体载体v质粒质粒DNA与病毒或噬菌体与病毒或噬菌体DNA组成的载组成的载体体v质粒质粒DNA与染色体与染色体DNA片段组成的载体片段组成的载体2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 133.2 质粒克隆载体质粒克隆载体3.2.1 质粒的生物学特性质粒的生物学特性3.2.1.1 质粒质粒DNA的复制的复制3.2.1.2 质粒质粒DNA的不亲和性或互不相容性的不亲和性或互不相容性3.2.1.3 质粒的转移和迁移性质粒的转移和迁移性3.2.1.4 质粒的重组性质粒的重组性3.2.1.5 显性质粒和隐性质粒显性质粒和隐性质粒3.2.2 质粒载体的构建质粒载

13、体的构建3.2.2.1 理想的质粒载体应具备的条件理想的质粒载体应具备的条件3.2.2.2 构建质粒载体应遵循的原则构建质粒载体应遵循的原则3.2.2.3 常见质粒载体及其构建常见质粒载体及其构建3.2.2.4 质粒载体的评价质粒载体的评价2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 14质粒（质粒（plasmid）v指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子。分子。v广泛存在于细菌细胞中，在某些蓝藻、真菌和绿藻细胞广泛存在于细菌细胞中，在某些蓝藻、真菌和绿藻细胞中也发现；在酵母、眼虫、衣藻等真核生物中也

14、存在。中也发现；在酵母、眼虫、衣藻等真核生物中也存在。v绝大多数为绝大多数为环状双链环状双链DNA分子；极少数为线性质粒和分子；极少数为线性质粒和RNA质粒。质粒。v环状双链质粒环状双链质粒DNA的三种构型：的三种构型：超螺旋超螺旋(SC)/共价闭合环形共价闭合环形(cccDNA,covalently closed circular DNA)；开环；开环(oc-DNA,open circular DNA)；线性；线性(L-DNA,linear DNA)2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 152022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学

15、们听课！Slide 162022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 173.2.1 质粒的生物学特性质粒的生物学特性v（一）自主复制性（一）自主复制性质粒质粒DNADNA携带有自己的复制起始区（携带有自己的复制起始区（oriori）以及一个）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体色体DNADNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，

16、所以其复制需要使用宿主细胞复制没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体染色体DNADNA的多种酶群。的多种酶群。（二）不相容性（二）不相容性利用同一复制系统的不同质粒（利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII RopRNAI RNAII Rop因因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优

17、势的质几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的中，这就是所谓的质粒不相容性质粒不相容性。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 18v（三）可扩增性（三）可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类：质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制松弛型复制及及严谨型复制严谨型复制。pMB1pMB1或或ColEIColEI类质粒复制子的复制完全类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白

18、因子（DNADNA聚合酶聚合酶I I，IIIIII，RNARNA聚合酶以及聚合酶以及dnaBdnaB、dnaCdnaC、dnaDdnaD、dnaZdnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1pMB1或或ColEIColEI复制子复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚以积聚2000-30002000-3000个拷贝，这叫做个拷贝，这叫做氯霉素

19、扩增。氯霉素扩增。但另外两种质粒（但另外两种质粒（psc101psc101和和p15Ap15A）的复制子的复制受）的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。合成后，这类质粒便不能持续复制。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 19v（四）可转移性（四）可转移性在天然条件下，很多天然质粒都可以通在天然条件下，很多天然质粒都可以通过过细菌接合细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的外一种宿主内，这种转

20、移依赖于质粒上的tratra基因产物。基因产物。3.2.1.1 质粒质粒DNA的复制的复制v受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制v质粒：质粒：（1）复制起点）复制起点 （2）控制）控制质粒质粒DNA复制强度复制强度的有关基因：的有关基因：cop:指令宿主细胞合成阻遏物，阻遏物的累积阻指令宿主细胞合成阻遏物，阻遏物的累积阻止质粒的继续复制。止质粒的继续复制。rep:指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制复制。par序列序列:该序列附着在细胞膜上，使质粒分子在该序列附着在细胞膜上，使质粒分子在细胞分裂时正确地分配到子细胞

21、中，维持相对稳定的细胞分裂时正确地分配到子细胞中，维持相对稳定的拷贝数。拷贝数。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 20松弛型和严谨型质松弛型和严谨型质粒粒v拷贝数拷贝数（copies）：指一个宿主细胞内某种质粒的数：指一个宿主细胞内某种质粒的数量与宿主染色体数量（通常为一条染色体）之比。量与宿主染色体数量（通常为一条染色体）之比。v严谨严谨型质粒型质粒(stringent plasmid):拷贝数为拷贝数为1至几个的至几个的质粒。质粒。v松弛型质粒松弛型质粒(relaxed plasmid):拷贝数多于拷贝数多于10个的质粒。个的质粒。v严谨或松弛

22、与质粒的大小及宿主类型有关。严谨或松弛与质粒的大小及宿主类型有关。v含松弛型质粒的细菌在含含松弛型质粒的细菌在含氯霉素氯霉素的培养基中培养时，可的培养基中培养时，可使质粒大量扩增。使质粒大量扩增。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 213.2.1.2 质粒质粒DNA的不亲和性或互的不亲和性或互不相容性不相容性（incompatibility）v指在无选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的指在无选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一个寄主细胞中稳定共存的现不同质粒不能在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。象。v亲和性质粒亲和性质粒：指能同寓于

23、一细胞中的不同质粒。：指能同寓于一细胞中的不同质粒。v不亲和性质粒不亲和性质粒：指不能同寓于一细胞中的不同质：指不能同寓于一细胞中的不同质粒。一般为粒。一般为亲缘关系密切亲缘关系密切的质粒的质粒；野生型质粒与野生型质粒与其衍生的重组质粒其衍生的重组质粒。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 222022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 23质粒不亲和性的机制质粒不亲和性的机制v受相同阻遏物的制约受相同阻遏物的制约v在细胞膜上有相同的结合位点在细胞膜上有相同的结合位点3.2.1.3 质粒的转移和迁移质粒的转移和迁移接

24、合质粒接合质粒(conjugative plasmid)：v指质粒所携带的指质粒所携带的基因基因的功能是使细胞彼此有效地接触，的功能是使细胞彼此有效地接触，以便将质粒以便将质粒DNA从供体细胞转移至受体细胞。如：质从供体细胞转移至受体细胞。如：质粒上的粒上的tra基因基因使宿主细胞（大肠杆菌）产生菌毛，合使宿主细胞（大肠杆菌）产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合。成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合。v分子较大、拷贝数少、宿主广、自行接合转移、较不安分子较大、拷贝数少、宿主广、自行接合转移、较不安全。如：全。如：F质粒、质粒、Ti质粒等质粒等。非接合质粒非接合质粒(no

25、n-conjugative plasmid)：v分子小、拷贝数多、不会自行接合转移，安全。如：分子小、拷贝数多、不会自行接合转移，安全。如：ColE1质粒等。质粒等。v基因工程中选用基因工程中选用2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 24迁移作用迁移作用(mobilization)v指在接合质粒的共存下引发的非接合质粒的转移指在接合质粒的共存下引发的非接合质粒的转移特性。特性。v由由 mob和和bom两个基因控制两个基因控制v基因工程常利用基因工程常利用mob和和bom基因缺陷基因缺陷型（型（mob,bom）的质粒和菌株）的质粒和菌株2022年7月20

26、日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 253.2.1.4 质粒的重组性质粒的重组性v由由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。上。v在基因工程应用的是重组缺陷型（在基因工程应用的是重组缺陷型（rec）的质）的质粒和菌株。粒和菌株。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 263.2.1.5 显性质粒和隐性质显性质粒和隐性质粒粒v显性质粒显性质粒（表达型质粒（表达型质粒）：指携带除与自身复制和转移：指携带除与自身复制和转移相关的基因，还携带一些使宿主细胞呈现新性状基因的相关的基因，还携带一些使宿

27、主细胞呈现新性状基因的质粒。如：质粒。如：抗抗菌素的抗性质抗抗菌素的抗性质粒（粒（R质粒质粒）；产大肠杆）；产大肠杆菌菌素（素（colicins）的）的Col质粒质粒；引起细胞接合的育性质；引起细胞接合的育性质粒（粒（F质粒）；降解金属有机物、芳香烃和农药等毒物质粒）；降解金属有机物、芳香烃和农药等毒物降解的降解质粒；及致植物形成冠瘿瘤的降解的降解质粒；及致植物形成冠瘿瘤的Ti质粒。质粒。v隐性质粒隐性质粒：宿主含有某种质粒，但无异样的性状表现出：宿主含有某种质粒，但无异样的性状表现出来，这样的质粒称隐性质粒。来，这样的质粒称隐性质粒。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同

28、学们听课！Slide 272022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 28根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类vFertility/F质粒质粒：只含有：只含有tra基因，除了促进接基因，除了促进接合转移外没有其他功能。合转移外没有其他功能。Resistance/R质粒：质粒：含有氯霉素、青霉素等含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。，发现于假单胞杆菌。Col 质粒：质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于如存在于E.coli 中的中的CoE1。v降解质粒（降解质粒（Degradative

29、 plasmids）:可以降可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。致瘤质粒（致瘤质粒（Virulence plasmids）：）：农杆菌农杆菌Ti质粒。质粒。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 29v利用抗性基因进行重组子的筛选2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 303.2.2 质粒载体的构建质粒载体的构建3.2.2.1 理想的质粒载体应具备的条件理想的质粒载体应具备的条件3.2.2.2 构建质粒载体应遵循的原则构建质粒载体应遵循的原则3.2.2.3 常见质粒载体及其构建常见质粒

30、载体及其构建3.2.2.4 质粒载体的评价质粒载体的评价2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 31引序v（一）天然存在的两种质粒（一）天然存在的两种质粒v（1）colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cell（2）pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复制5copy/cell标记基因为Tcrv质粒的命名 p小写代表质粒；后面有两至三个大写字母代表发现者或构建者的姓名。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 32v（二）质粒人工构建的目的天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因

31、工程的载体必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。3.2.2.1 理想的质粒载体应具备的条件理想的质粒载体应具备的条件v分子量较小。分子量较小。v松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。v具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有一个强的选择标

32、记。还要有一个强的选择标记。v具有允许外源具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。v能够导入寄主细胞，具备转化的功能。能够导入寄主细胞，具备转化的功能。v操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载体。途的质粒载体。v天然质粒载体的局限性天然质粒载体的局限性：天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒都是人工构建的质粒。2022年7月20日

33、22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 333.2.2.2 构建质粒载体应遵循的原则构建质粒载体应遵循的原则v选用合适的出发质粒选用合适的出发质粒v正确获得构建质粒克隆载体的元件正确获得构建质粒克隆载体的元件v根据要转化的受体细胞的特性，组装合适的选择根据要转化的受体细胞的特性，组装合适的选择标记基因。标记基因。v构建质粒表达载体，选用合适的启动子。构建质粒表达载体，选用合适的启动子。v力求构建过程简单化力求构建过程简单化2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 343.2.2.3 常见质粒载体及其常见质粒载体及其构建构建人工构建的质粒

34、根据其功能及用途分为人工构建的质粒根据其功能及用途分为:1.1.多拷贝质粒多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。用于扩增外源基因。2.2.测序质粒测序质粒3.3.整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上4.4.穿梭质粒穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制同的受体细胞中复

35、制2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 352022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 365.5.表达质粒表达质粒 装有强的启动基因，合适的装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达在受体细胞内的高效表达6.6.探针质粒探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件，通筛选克隆或寻找基因元件，通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等如抗性基因。筛选启动基因、终止子等(下下图图

36、)。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 37实验室常用质粒：实验室常用质粒：v1.pBR322质粒载体的构建：质粒载体的构建：v出发质粒：出发质粒：pMB1:类似松弛型类似松弛型ColE1质粒质粒 pSF2124:含含Ampr基因基因 pSC101:含含Tcr基因基因2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 382022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 39pBR322质粒载体的优缺点质粒载体的优缺点优点：优点：v分子量小：分子量小：4363bp,容易纯化。容易纯化。v含有含

37、有2个抗生素抗性基因个抗生素抗性基因Ampr和和Terr，可以作为选择，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入可以插入DNA，amp基因内可被基因内可被Pst I,Pvu I,Sac I切开，而切开，而四环素抗性基因四环素抗性基因可被可被BamH I,Hind III切开，切开，通过插入失活筛选重组子。通过插入失活筛选重组子。v受体细胞内，受体细胞内，pBR322pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到内可达到1515个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，

38、如氯霉素，可达到如氯霉素，可达到1000-30001000-3000拷贝，拷贝，cpoies。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 40缺点：缺点：v有被动迁移的可能，不够安全。有被动迁移的可能，不够安全。v抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。麻烦。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 41pBR322质粒质粒载体载体2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 422.pBR327：一个多拷贝质粒vpBR327pBR327是在是在

39、pBR322pBR322的基础上去掉了的基础上去掉了10891089bpbp的的片段，留下了片段，留下了ampRampR和和tetRtetR的完整片段，但改的完整片段，但改变了质粒的复制和接合能力。他与变了质粒的复制和接合能力。他与pBR322pBR322这这要有两点不同：要有两点不同：1 1）pBR327pBR327比比pBR322pBR322有更高的拷贝有更高的拷贝，每，每个细胞中含有个细胞中含有30-4530-45个拷贝。但正常细胞中较个拷贝。但正常细胞中较高的拷贝数，使它适合于应用于高的拷贝数，使它适合于应用于基因功能基因功能研研究。究。2 2）剪切破坏了剪切破坏了pBR322pBR3

40、22的接合能力，的接合能力，pBR327pBR327不具有接合能力，不具有接合能力，不能直接转入其他不能直接转入其他细胞细胞。这对生物。这对生物biological containmentbiological containment是是非常重要的（生物防范）。非常重要的（生物防范）。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 43pBR327：一个多拷贝质粒2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 443.pUC83.pUC8Lac Lac 选择质粒选择质粒vpUC8pUC8也来自于也来自于pBR322pBR322，但只

41、保留了，但只保留了复制起点复制起点和和ampRampR位点，位点，ampRampR基因的序列已改变限制性位点不再存在基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在所有的克隆位点集中在lacZlacZ基因内的一个小片段上。基因内的一个小片段上。pUC8pUC8的优点：的优点：1 1）突变位点位于复制起点，复制前可以使细胞）突变位点位于复制起点，复制前可以使细胞中质粒的拷贝数达到中质粒的拷贝数达到500-700500-700个，可以提高载体的个，可以提高载体的产量。产量。2)2)重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加ampamp和和X-galX-

42、gal,IPTGIPTG，节约了一半的时间。，节约了一半的时间。3 3）pUC8pUC8的的多克隆位点多克隆位点，可以使具有不同粘端的，可以使具有不同粘端的DNADNA片段插入载体，而不必连接片段插入载体，而不必连接linkerlinker。4 4）载体中的多克隆位点与）载体中的多克隆位点与M13mpM13mp系列的载体是相系列的载体是相同的，因此，插入同的，因此，插入pUCpUC系列的克隆系列的克隆DNADNA可以直接转入可以直接转入M13mpM13mp载体，可以进行载体，可以进行DNADNA测序和体外定点突变。测序和体外定点突变。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学

43、们听课！Slide 452022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 464.pGEM3Z-DNA的体外转录vpGEM3ZpGEM3Z与与pUCpUC载体非常相似，不同的是载体非常相似，不同的是pGEM3ZpGEM3Z含有含有两段额外的短的两段额外的短的DNADNA片段片段，每一段可以作，每一段可以作为为RNARNA聚合酶的识别位点聚合酶的识别位点。这两段启动子存在。这两段启动子存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的的pGEM3ZpGEM3Z载体中加入载体中加入RNARNA聚合酶聚合酶，可以发生转，可以发生转录，

44、合成的录，合成的RNARNA可以作为探针使用，或者研究可以作为探针使用，或者研究RNARNA的加工过程或者蛋白质的合成。的加工过程或者蛋白质的合成。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 472022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 48实验一 质粒的制备v实验课上具体讲解3.2.2.4 质粒载体的评价质粒载体的评价v操作简便操作简便v克隆容量有限（克隆容量有限（10kb）2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 493.3 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体3.3.1

45、 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性3.3.2 噬菌体载体噬菌体载体3.3.3 柯斯载体柯斯载体3.3.4 M13单链丝状噬菌体载体单链丝状噬菌体载体2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 50噬菌体噬菌体(phage)v感染细菌的病毒感染细菌的病毒2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 513.3.1 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性v具有对寄主的依赖性。利用寄主的蛋白合成具有对寄主的依赖性。利用寄主的蛋白合成和复制系统进行生长和繁殖。和复制系统进行生长和繁殖。v具有高感染性具有高感染性v感染途径：感染途径

46、：溶菌生长；溶原生长溶菌生长；溶原生长2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 52噬菌体溶菌生长噬菌体溶菌生长v溶菌生长溶菌生长:噬菌体感染宿主细胞后，大量增殖子代噬菌体颗噬菌体感染宿主细胞后，大量增殖子代噬菌体颗粒，使宿主细胞裂解，释放出来的病毒颗粒又再感染粒，使宿主细胞裂解，释放出来的病毒颗粒又再感染其它细胞，这种周而复始的生命过程（生活周期）称其它细胞，这种周而复始的生命过程（生活周期）称溶菌生长溶菌生长。v烈性噬菌体：烈性噬菌体：噬菌体感染宿主细胞后，噬菌体感染宿主细胞后，DNA不整合到宿主染不整合到宿主染色体，只进行溶菌生长，这样的噬菌体称烈性

47、噬菌体。色体，只进行溶菌生长，这样的噬菌体称烈性噬菌体。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 53噬菌体溶原生长噬菌体溶原生长v溶原生长溶原生长：噬菌体感染细菌，噬菌体感染细菌，DNA整合到寄主染色体中，随整合到寄主染色体中，随寄主细胞染色体的复制而复制，寄主细胞仍然正常分裂，并不死寄主细胞染色体的复制而复制，寄主细胞仍然正常分裂，并不死亡，这种生命过程叫作溶原生长。亡，这种生命过程叫作溶原生长。v温和噬菌体温和噬菌体（temperate phage）：病毒感染宿主细胞后）：病毒感染宿主细胞后DNA整合到寄主染色体中，无感染其它细胞的能力，这样的病毒，

48、称整合到寄主染色体中，无感染其它细胞的能力，这样的病毒，称温和噬菌体。温和噬菌体。v溶原性细菌溶原性细菌（lysogen）：细菌染色体中整合有噬菌体基因组）：细菌染色体中整合有噬菌体基因组的细菌。对同种噬菌体具有免疫性。的细菌。对同种噬菌体具有免疫性。v溶原化溶原化（lysogenization）：用温和噬菌体感染细菌使之成为）：用温和噬菌体感染细菌使之成为溶原性细菌的过程溶原性细菌的过程。v原噬菌体原噬菌体（prophage）：在溶原性细菌内存在的整合噬菌体）：在溶原性细菌内存在的整合噬菌体DNA，称原噬菌体。，称原噬菌体。2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

49、Slide 543.3.2 噬菌体载体噬菌体载体3.3.2.1 噬菌体的性质噬菌体的性质3.3.2.2 噬菌体载体构建的原理噬菌体载体构建的原理3.3.2.3 重组重组 DNA分子的体外包装分子的体外包装3.3.2.4 噬菌体载体的评价噬菌体载体的评价2022年7月20日22时53分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 553.3.2.1 噬菌体的性质噬菌体的性质v野生型入噬菌体野生型入噬菌体DNA为双链线性分子为双链线性分子v黏性末端黏性末端(cohesive end)：线性分子左右两端各有线性分子左右两端各有12bp组成的组成的5端突出的粘性末端端突出的粘性末端，DNA进入宿主细

50、胞进入宿主细胞后黏性末端连接形成环后黏性末端连接形成环DNA分子。分子。vcos位点位点(cohesive end site)：指在连接酶的作用下，：指在连接酶的作用下，连接上述黏性末端结合形成的双链连接上述黏性末端结合形成的双链DNA区段。又称区段。又称黏黏性末端位点性末端位点。v全长全长48,502 bp，约有，约有20kb的区域为为噬菌体的区域为为噬菌体生长非必生长非必需需的，可以缺失或被外源的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。片段所取代。v入噬菌体入噬菌体DNA分子上有分子上有56种限制性核酸内切酶识别位种限制性核酸内切酶识别位点。点。v温和噬菌体，易于在溶源生长保存，在溶菌生长增殖