植物代谢组学课件(PPT 42页).pptx
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1、植物代谢组学及其应用植物代谢组学及其应用河南农业大学生命科学学院赵会杰第1页,共42页。目 录一、植物代谢组学的概念和意义一、植物代谢组学的概念和意义二、代谢组学在系统生物学中的地位二、代谢组学在系统生物学中的地位三、植物代谢组学的研究方法三、植物代谢组学的研究方法四、代谢组学在植物科学中的应用四、代谢组学在植物科学中的应用五、展望五、展望第2页,共42页。一、植物代谢组学的概念和意义一、植物代谢组学的概念和意义1、概念、概念生物学中生物学中“组组”的概念:的概念:“组组”:来源于希腊语:来源于希腊语ome,意指每个、所有、全部。,意指每个、所有、全部。以它为后缀最先用于基因组:以它为后缀最先
2、用于基因组:genome,指一个物种的指一个物种的全部遗传组成。全部遗传组成。自基因组学概念提出后,带组学(自基因组学概念提出后,带组学(omics)的概念出的概念出现有现有200多种。如蛋白组学、代谢组学等。多种。如蛋白组学、代谢组学等。第3页,共42页。近年来近年来,随着生命科学研究的发展随着生命科学研究的发展,尤其是完成拟南尤其是完成拟南芥芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(和水稻(Oryza sativa)等植等植物的基因组测序后物的基因组测序后,植物科学发生了翻天覆地的变化。植物科学发生了翻天覆地的变化。有人说生命科学研究跨入了后基因组时代。有人说生命科学研究跨入了
3、后基因组时代。人们已经把目光从基因的测序转移到了基因的功人们已经把目光从基因的测序转移到了基因的功能研究。在研究能研究。在研究DNA的基因组学、的基因组学、mRNA的转录组学的转录组学和蛋白质的蛋白组学后和蛋白质的蛋白组学后,接踵而来的是研究代谢物的代接踵而来的是研究代谢物的代谢组学。谢组学。第4页,共42页。代谢组:代谢组:是指细胞或者生物体内的所有代谢物的总和,也有人将它定义为细胞、组织、器官或者生物体内的所有小分子代谢组分的集合。代谢组学:代谢组学:通过大量代谢成分的定性、定量分析来定义生物体的生化表型(代谢表型)及其与基因型的关系,从而为研究基因功能、诠释生命现象提供大量的代谢信息,这
4、就是代谢组学(metabolomics)。第5页,共42页。2、意义、意义 通过研究不同物种的代谢产物通过研究不同物种的代谢产物,可以指导植物分类可以指导植物分类学学,对植物进行更加合理的分类对植物进行更加合理的分类;通过研究不同基因型植物的代谢物通过研究不同基因型植物的代谢物,可以发现新的功能基可以发现新的功能基因因,促进转基因植物的研究促进转基因植物的研究,同时还可以对转基因植物及其在同时还可以对转基因植物及其在食用方面的安全性进行代谢物组学水平上的评估食用方面的安全性进行代谢物组学水平上的评估;通过研究不同生态环境下植物的代谢产物通过研究不同生态环境下植物的代谢产物,了解植物的了解植物的
5、区域性分布。如果所研究的植物是某种药用植物区域性分布。如果所研究的植物是某种药用植物,则就可以则就可以应用于中药道地药材的确定应用于中药道地药材的确定;植物在受到某种内部或外界因素刺激之后会产生的特植物在受到某种内部或外界因素刺激之后会产生的特定的应激变化定的应激变化,最终会表现在代谢物的改变上最终会表现在代谢物的改变上,通过研究这通过研究这种变化规律种变化规律,为从植物中定向培养得到某一特定代谢物提供为从植物中定向培养得到某一特定代谢物提供指导。指导。第6页,共42页。20 20世纪末到本世纪初,大规模的基因组测序工作产世纪末到本世纪初,大规模的基因组测序工作产生了海量数据。但仅仅是依赖生了
6、海量数据。但仅仅是依赖DNADNA序列我们能够得到的信序列我们能够得到的信息还是有限的,科学家迫切希望在整体水平上了解基因息还是有限的,科学家迫切希望在整体水平上了解基因表达的特征和基因所编码的产物的功能。因此,表达的特征和基因所编码的产物的功能。因此,“功功能基因组学能基因组学(functional genomics)”(functional genomics)”的研究逐渐兴起。的研究逐渐兴起。它是通过大规模地分析细胞内转录水平它是通过大规模地分析细胞内转录水平(转录组转录组)和蛋白和蛋白质水平质水平(蛋白质组蛋白质组)上的变化,进而推测基因功能,这就上的变化,进而推测基因功能,这就开启了开
7、启了“功能基因组学功能基因组学”的研究。的研究。二、代谢组学在系统生物学中的地位二、代谢组学在系统生物学中的地位第7页,共42页。然而,转录组和蛋白质组不一定能很好地预测基因的功能。尽然而,转录组和蛋白质组不一定能很好地预测基因的功能。尽管转录组携带了细胞内蛋白质合成的密码子,但是管转录组携带了细胞内蛋白质合成的密码子,但是mRNAmRNA水平上的增水平上的增加与蛋白质水平的增加并不一致,况且蛋白质合成后的各种修饰往加与蛋白质水平的增加并不一致,况且蛋白质合成后的各种修饰往往带来活性的改变。考虑到这些因素,仅凭转录组或者蛋白质组的往带来活性的改变。考虑到这些因素,仅凭转录组或者蛋白质组的改变不
8、一定能够准确预测生化表型改变不一定能够准确预测生化表型(代谢物代谢物)的改变。的改变。另外,在建立转录谱和蛋白谱的时候,要鉴定一种另外,在建立转录谱和蛋白谱的时候,要鉴定一种mRNAmRNA或者蛋或者蛋白质,现代的技术手段主要是通过序列相似性比对和与数据库的匹白质,现代的技术手段主要是通过序列相似性比对和与数据库的匹配来确定的,这样的鉴定主要依赖于匹配度,因此不是直接的。由配来确定的,这样的鉴定主要依赖于匹配度,因此不是直接的。由于现有数据库信息的缺乏,转录组和蛋白质组也就只能提供有限的于现有数据库信息的缺乏,转录组和蛋白质组也就只能提供有限的信息。信息。代谢组可以在代谢物的基础上来区分表型;
9、不论是可见的还是代谢组可以在代谢物的基础上来区分表型;不论是可见的还是不可见的表型,用代谢物来区分可能是更无偏见的,至少是提供了不可见的表型,用代谢物来区分可能是更无偏见的,至少是提供了代谢水平上的证据。而且,在那些由突变体或者转基因造成的可以代谢水平上的证据。而且,在那些由突变体或者转基因造成的可以测量的表型变化的实例中,代谢组的方法可以被用来阐明造成这种测量的表型变化的实例中,代谢组的方法可以被用来阐明造成这种可见表型的生化原因或者结果。可见表型的生化原因或者结果。第8页,共42页。因此,以因此,以DNADNA、mRNAmRNA、蛋白质和代谢物为研究对象的基因组学、蛋白质和代谢物为研究对象
10、的基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学是一个密切相关的整体,他们共同转录组学、蛋白质组学和代谢组学是一个密切相关的整体,他们共同构成系统生物学(构成系统生物学(systems biology)systems biology)。基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的关系基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的关系第9页,共42页。系统生物学研究的四个层次系统生物学研究的四个层次第10页,共42页。代谢组学研究技术步骤代谢组学研究技术步骤三、植物代谢组学的研究方法三、植物代谢组学的研究方法植物材料培养植物材料培养数据分析与解释数据分析与解释样品制备样品制备成分分析与鉴定成分分析与鉴定第11页,共42页。
11、1、植物培养(栽培)、植物培养(栽培)对研究对象进行培育的目的是为了对样本的稳对研究对象进行培育的目的是为了对样本的稳定性进行控制定性进行控制,相对于微生物和动物而言相对于微生物和动物而言,植物的植物的人工栽培需要考虑更多的问题人工栽培需要考虑更多的问题,如中药材在不同年龄、如中药材在不同年龄、不同发育阶段、不同部位以及光照、水肥、耕作等不同发育阶段、不同部位以及光照、水肥、耕作等环境因素的微小差异都可引起生理状态的变化环境因素的微小差异都可引起生理状态的变化,而这而这些非可控及可控双重因素的影响很难进行精确的控些非可控及可控双重因素的影响很难进行精确的控制制,从而影响药用植物代谢组研究的重复
12、性。为了解从而影响药用植物代谢组研究的重复性。为了解决以上问题决以上问题,推荐使用大容量的培养箱推荐使用大容量的培养箱,定时更换定时更换培养箱中栽培对象的位置培养箱中栽培对象的位置,以及使用无土栽培技术等以及使用无土栽培技术等,利用无土栽培系统将水和养分直接引入植物根部利用无土栽培系统将水和养分直接引入植物根部,并并且对供给量进行精确地控制且对供给量进行精确地控制,大大提高了实验的重大大提高了实验的重复性。复性。第12页,共42页。植物代谢物样品制备分为组织取样匀浆抽提保存样品预处理等步骤。代谢产物通常用水或有机溶剂(如甲醇和己烷等)分别提取,获得水提取物和有机溶剂提取物,从而把非极性的亲脂相
13、和极性相分开。分析之前,通常先用固相微萃取、固相萃取和亲和色谱等方法进行预处理。然而植物代谢物千差万别,其中很多物质稍受干扰结构就会发生改变,且对其分析鉴定所采用的设备也不同。目前还没有适合所有代谢物的抽提方法,通常只能根据所要分析的代谢物特性及使用的鉴定手段选择合适的提取方法。而抽提时间、温度、溶剂成分和质量及实验者的技巧等诸多因素也将影响样品制备的水平。2、样品制备、样品制备第13页,共42页。对获得的样品中所有代谢物进行分析鉴定是代谢组学研究的关对获得的样品中所有代谢物进行分析鉴定是代谢组学研究的关键步骤键步骤,也是最困难和多变的步骤。也是最困难和多变的步骤。与原有的各种组学技术只分析特
14、定类型的物质不同与原有的各种组学技术只分析特定类型的物质不同,代谢组学分析对代谢组学分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学参数差异很大理化学参数差异很大,要对它们进行无偏向的全面分析要对它们进行无偏向的全面分析,单一的分离分析手单一的分离分析手段往往难以保证。色谱、质谱、核磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸段往往难以保证。色谱、质谱、核磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检测和光散射等分离分析手段及其组合都被应用于收、荧光散射、发射性检测和光散射等分离分析手段及其组合都被应用
15、于代谢组学的研究。一般根据样品的特性和实验目的代谢组学的研究。一般根据样品的特性和实验目的,可选择最合适的分析可选择最合适的分析方法。方法。目前最常用的分离分析手段:目前最常用的分离分析手段:气相色谱和质谱联用气相色谱和质谱联用(GC/MS)(GC/MS)液相色谱和质谱联用液相色谱和质谱联用(LC/MS)(LC/MS)毛细管电泳质谱联用技术毛细管电泳质谱联用技术(CE/MS)(CE/MS)核磁共振核磁共振(NMR)(NMR)傅里叶变换红外光谱与质谱联用傅里叶变换红外光谱与质谱联用(FTIR/MS)(FTIR/MS)。3 3、成分分析鉴定、成分分析鉴定第14页,共42页。(1)气相色谱和质谱联用
16、气相色谱和质谱联用(GC/MS)液相色谱和质谱联用液相色谱和质谱联用(LC/MS)色谱是最常用和有效的分离分析工具色谱是最常用和有效的分离分析工具,其与质谱的联用则其与质谱的联用则可以完成从成分分离到鉴定的一整套工作。可以完成从成分分离到鉴定的一整套工作。GC/MSGC/MS和和LC/MSLC/MS可可以同时检测出数百种化合物以同时检测出数百种化合物,包括糖类、有机酸、氨基酸、脂包括糖类、有机酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代谢物。肪酸和大量不同的次生代谢物。GC/MS GC/MS有很好的分离效率且相对较为经济有很好的分离效率且相对较为经济,但需要对但需要对样品进行衍生化预处理样品进行衍生化
17、预处理,这一步骤会耗费额外的时间这一步骤会耗费额外的时间,甚甚至引起样品的变化。受此限制至引起样品的变化。受此限制,GC/MS,GC/MS无法分析膜脂等热无法分析膜脂等热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。第15页,共42页。For example:Roessner等等(2000,2001)利用利用GC/MS对马铃薯对马铃薯进行高通量代谢物分析进行高通量代谢物分析,同时检测到同时检测到150种化合物种化合物,其中其中77种被鉴定为氨基酸、有机酸或糖。种被鉴定为氨基酸、有机酸或糖。利用利用GC/MS进行代谢组学研究的代表性工作进行代谢组学研究的代表性工作是
18、是Fiehn等等(2000)的一系列有关植物代谢的研究。的一系列有关植物代谢的研究。他们用他们用GC/MS对模式植物拟南芥的叶子提取物对模式植物拟南芥的叶子提取物进行了研究进行了研究,定量分析了定量分析了326个化合物个化合物,并确定了并确定了其中部分化合物的结构。其中部分化合物的结构。第16页,共42页。LC/MS LC/MS中目前应用较广的是高效液相色谱和质中目前应用较广的是高效液相色谱和质谱联用谱联用(HPLC/MS)(HPLC/MS)。HPLCHPLC与与GCGC原理相似原理相似,但在进样但在进样前不需进行衍生化处理前不需进行衍生化处理,适合那些不稳定、不易衍适合那些不稳定、不易衍生化
19、、不易挥发和分子量较大的化合物。生化、不易挥发和分子量较大的化合物。HPLC/MSHPLC/MS选择性和灵敏度都较好选择性和灵敏度都较好,但分析的时间相对较长但分析的时间相对较长,且需依赖纯的参照物。且需依赖纯的参照物。Fiehn(2003)Fiehn(2003)利用利用HPLC/MSHPLC/MS检测笋瓜检测笋瓜(Cucurbitamaxima Gelber Zentner)Cucurbitamaxima Gelber Zentner)叶柄和叶片抽叶柄和叶片抽提物提物,检测到了超过检测到了超过400400种代谢物种代谢物,有有9090种被定性种被定性,其中其中大部分是氨基酸、糖和糖苷。大部分
20、是氨基酸、糖和糖苷。Huhman Huhman和和Sumner(2002)Sumner(2002)在紫花苜蓿和蒺藜状苜在紫花苜蓿和蒺藜状苜蓿中各鉴定出蓿中各鉴定出1515个和个和2727个皂角甙个皂角甙,并在紫花苜蓿中找并在紫花苜蓿中找到了到了2 2个新的乙二酸皂角甙。个新的乙二酸皂角甙。第17页,共42页。(2)毛细管电泳质谱联用技术)毛细管电泳质谱联用技术(CE/MS)CE/MS CE/MS分离样品效率比普通的色谱质谱联分离样品效率比普通的色谱质谱联用要高得多用要高得多,更为便利的是其耗时很短更为便利的是其耗时很短,往往往往在在1010分钟内就能完成一个样品的分析过程。分钟内就能完成一个样
21、品的分析过程。Tolstikov Tolstikov等等(2003)(2003)用用CE/MSCE/MS对拟南芥进行对拟南芥进行代谢组分析代谢组分析,分离效果远远超过了分离效果远远超过了FiehnFiehn等用等用GC/MSGC/MS进行的先期工作进行的先期工作,检测到超过检测到超过700700个不同的个不同的色谱峰值色谱峰值,其中包括许多以前未检测到的脂类化其中包括许多以前未检测到的脂类化合物及次生代谢物。合物及次生代谢物。第18页,共42页。(3)核磁共振)核磁共振 在代谢组学领域在代谢组学领域,核磁共振最初被用于病理生理学和药核磁共振最初被用于病理生理学和药理毒理学方面,但目前也已被广泛
22、用于植物代谢组学研究。理毒理学方面,但目前也已被广泛用于植物代谢组学研究。其优点是:其优点是:A.A.不同于质谱具有离子化程度和基质干扰等问题不同于质谱具有离子化程度和基质干扰等问题,NMR,NMR没没有偏向性有偏向性,对所有化合物的灵敏度是一样的。对所有化合物的灵敏度是一样的。B.B.NMRNMR无损伤性无损伤性,不破坏样品的结构和性质不破坏样品的结构和性质,可在接近生理可在接近生理条件下进行实验条件下进行实验,可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件件,可以进行实时和动态的检测。可以进行实时和动态的检测。C.C.NMRNMR氢谱的谱峰与样品中各化合物的
23、氢原子是一一对氢谱的谱峰与样品中各化合物的氢原子是一一对应的应的,所测样品中的每一个氢原子在图谱中都有其相关的谱所测样品中的每一个氢原子在图谱中都有其相关的谱峰峰,图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量,更为直观。更为直观。因此因此,NMR,NMR方法很适合研究代谢产物中的复杂成分。方法很适合研究代谢产物中的复杂成分。第19页,共42页。Examples:Examples:Ward Ward等等(2003)(2003)用用1 1H-NMRH-NMR对多种不同生态型的拟南芥进行了对多种不同生态型的拟南芥进行了代谢组分析代谢组分析,在碳水化合物
24、和脂肪族物质中都发现了差异在碳水化合物和脂肪族物质中都发现了差异,说明了说明了植物代谢物和生态型差异的相关性。植物代谢物和生态型差异的相关性。Hyung-Kyoon Hyung-Kyoon等等(2004)(2004)用用1 1H-NMRH-NMR对野生型和过表达水杨对野生型和过表达水杨酸合成基因的转基因烟草酸合成基因的转基因烟草(Nicotiana tabacumNicotiana tabacum)的叶片和叶脉的叶片和叶脉进行了研究进行了研究,通过进行通过进行TMVTMV嫁接和对照实验嫁接和对照实验,得到多个峰值变化得到多个峰值变化,大部分峰被鉴定为氯原酸、苹果酸和糖。此实验提供了一种有大部分
25、峰被鉴定为氯原酸、苹果酸和糖。此实验提供了一种有效的不需过多步预处理程序的区分野生型和转基因植物的方法。效的不需过多步预处理程序的区分野生型和转基因植物的方法。NMRNMR也有其缺点也有其缺点:与与GC/MSGC/MS和和LC/MSLC/MS相比相比,NMR,NMR的缺点是灵敏度低的缺点是灵敏度低,有可能形成有可能形成信号重叠信号重叠,且其对样品制备的要求很高。且其对样品制备的要求很高。因为动态范围有限因为动态范围有限,很难同时测定生物体系中共存的很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物。浓度相差较大的代谢产物。第20页,共42页。(4)傅里叶变换红外光谱)傅里叶变换红外光谱-质谱联
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