第14章基因工程课件.ppt

1、 Genetic Recombination and Genetic Engineering第第 十十 四四 章章n基因重组基因重组(gene recombination)(gene recombination)是指是指DNADNA片段在片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。n基因工程基因工程(genetic engineering(genetic engineering）是指采用人）是指采用人工方法将不同来源的工方法将不同来源的DNADNA进行重组，并将重组后进

2、行重组，并将重组后的的DNADNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。第第 一一 节节DNADNA的重组的重组 DNA RecombinationDNA RecombinationDNADNA重组重组接合作用接合作用 (conjugation)(conjugation)转化作用转化作用 (transformation)(transformation)转导作用转导作用 (transduction)(transduction)转转 座座 (transposition)(transposition)同源重组同源重组 (homologous recombinatio

3、n)(homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)(site-specific recombination)发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组，又称又称基本重组基本重组。是最基本的是最基本的DNADNA重组方式重组方式，通，通过链的断裂和再连接，在两个过链的断裂和再连接，在两个DNADNA分子同源序分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。列间进行单链或双链片段的交换。以以E.coliE.coli的同源重组为例，了解同源重组的同源重组为例，了解同源重组机制的机制的Holl

4、idayHolliday模型。模型。一、同源重组一、同源重组(homologous recombination)(homologous recombination)两个同源染色体两个同源染色体DNADNA排列整齐排列整齐5 3 5 3 5 3 5 3 一个一个DNADNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNADNA对对应的链连接，形成应的链连接，形成HollidayHolliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNADNAHollidayHolliday模型中，同源重组主要模型中，同源重组主要4 4个关键步骤个关键步骤 内切酶内切酶 (recBCD

5、)(recBCD)DNADNA侵扰侵扰(recA)(recA)分支迁移分支迁移 (recA)(recA)内切酶内切酶(recBCD)(recBCD)DNADNA连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 HolidayHoliday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 HollidayHolliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNADNA，分别为：，分别为：1 1、片段重组体、片段重组体 （见模型图右边产物）

6、：（见模型图右边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本亲本DNADNA。2 2、拼接重组体、拼接重组体（见模型图左边产物）：（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本异源双链区的两侧来自不同亲本DNADNA。Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5

7、3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶拼接重组体拼接重组体片段重组体片段重组体二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒触时，质粒DNADNA从一个细胞（细菌）转移至从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的另一细胞（细菌）的DNADNA转移称为转移称为接合作用接合作用(conjugation)(conjugation)。可接合质粒如可接合质粒如 F F 因子因子(F factor)(F factor)质粒质粒 细菌染色

8、体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNADNA分子分子（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNADNA，使，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为称为转化作用转化作用 (transformation)(transformation)。例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNADNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。n19431943年，年，AveryAvery将将有毒型有毒型肺炎双球菌肺炎双球菌DNADNA与与无毒无毒型型肺炎双球菌一起培养，结果肺炎双球菌一起培养，结果使无毒型肺炎双使无

9、毒型肺炎双球菌转变为有毒型肺炎双球菌。球菌转变为有毒型肺炎双球菌。其原因就是有其原因就是有毒型肺炎双球菌毒型肺炎双球菌DNADNA进入无毒型肺炎双球菌中，进入无毒型肺炎双球菌中，引起其遗传性状改变。引起其遗传性状改变。（三）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的供体细胞与受体细胞之间的DNADNA转移及基因转移及基因重组即为重组即为转导作用转导作用(transduction)(transduction)。噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径

10、溶菌生长途径(lysislysis pathway)pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic(lysogenic pathway)pathway)例例n溶源生长途径（整合途径）：溶源生长途径（整合途径）：噬菌体整合进噬菌体整合进宿主细菌染色体，随宿主菌宿主细菌染色体，随宿主菌DNADNA复制而复制。复制而复制。n溶菌生长途径（裂解途径）溶菌生长途径（裂解途径）：噬菌体：噬菌体DNADNA在在宿主菌内迅速复制，溶解细菌，产生新生噬宿主菌内迅速复制，溶解细菌，产生新生噬菌体。菌体。转染：转染：是特殊形式的转化，是离体状态的完整是特殊形式的转化，是离体状态的完整的病毒噬菌体的

11、病毒噬菌体DNA/RNADNA/RNA感染受体菌而引起的后者感染受体菌而引起的后者遗传型和表型发生的变化遗传型和表型发生的变化当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的体细胞之间的DNADNA转移及基因重组即为转移及基因重组即为转导作用转导作用。溶源途径（整合）裂解途径三、位点特异重组三、位点特异重组位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination)(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两

12、个是由整合酶催化，在两个DNADNA序列的序列的特异位特异位点间点间发生的整合发生的整合作用：作用：参与表达的调节参与表达的调节发育过程中程序性的发育过程中程序性的DNA重排重排有些病毒或者质粒复制循环过程中发生的整合与切除有些病毒或者质粒复制循环过程中发生的整合与切除等等等等例例 （一）一）噬菌体噬菌体DNADNA的整合的整合噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNAcDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(lo

13、ng terminal(long terminal repeat,LTR)repeat,LTR)。例例（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变 hixhix为反向重复序列，它们之间的为反向重复序列，它们之间的H H片段片段可在可在HinHin控制下进行特异位点重组控制下进行特异位点重组(倒位倒位)。H H片段上有两个启动子片段上有两个启动子P P，其一驱动，其一驱动hinhin基因表基因表达，另一正向时驱动达，另一正向时驱动H2H2和和rH1rH1基因表达，反基因表达，反向向(倒位倒位)时时H2H2和和rH1rH1不表达

14、。不表达。rH1rH1为为H1H1的阻的阻遏蛋白基因。遏蛋白基因。H2 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白HinHin重组酶重组酶转位片段转位片段hinhinH2H2I IH1H1 H1 H1鞭毛素鞭毛素hinhinH2H2I IDNADNA启动序列启动序列H1H1启动序列启动序列沙门氏菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变例例（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig(Ig)，由两条轻链，由两条轻链(L(L链链)和和两条重链两条重链(H(H链链)组成，分别由三个独立的基组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链因族编码，其中两

15、个编码轻链(和和)，一个，一个编码重链。编码重链。轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V J C L V L V D D J C J C 重链重链(IgH(IgH)基因的基因的V-D-JV-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL(IgL)基因的基因的V-JV-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V V片段片段的下游，的下游，J J片段的上游以及片段的上游以及D D片段的两侧均存在片段的两侧均存在保守的重组信号序列保守的重组信号序列(recombination signal(recombination signal sequence,

16、RSS)sequence,RSS)。此重排的重组酶基因。此重排的重组酶基因rag rag(recombination activating gene)(recombination activating gene)共有两个，共有两个，分别产生蛋白质分别产生蛋白质RAG1RAG1和和RAG2RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免疫球

17、蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程四、转座重组四、转座重组由由插入序列和转座子插入序列和转座子介导的基因移位或介导的基因移位或重排称为重排称为转座转座(transposition)(transposition)。某些基因的位置在基因组中是可以变某些基因的位置在基因组中是可以变动的，如：插入序列，转座子动的，如：插入序列，转座子插入序列插入序列(insertion sequences,IS)(insertion sequences,IS)组成：组成：二个分离的反向重复序列二个分离的反向重复序列(inverted repeats,IR(inverted repeats,IR)特有的正向重复序列

18、特有的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposasetransposase)编码基因编码基因（当转座酶当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座）基因表达时，即可引起该序列的转座）IRIRTransposaseTransposase Gene GeneIRIR发生形式：发生形式：v保守性转座保守性转座(conservative transposition)(conservative transposition)v复制性转座复制性转座(duplicative transposition)(duplicative transposition)（一）插入序列转座（一）插入序列转座插入序列

19、的复制性转座插入序列的复制性转座（二）转座子转座（二）转座子转座 “如果你能脚踏实地从事研究并如实报告观察结果，同如果你能脚踏实地从事研究并如实报告观察结果，同时保持健康长寿，那么，你有可能获诺贝尔奖。时保持健康长寿，那么，你有可能获诺贝尔奖。”转座子转座子(transposons(transposons)可从一个染色体位点转移到另一位点可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。的分散重复序列。转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRIRIRTransposaseTransposase Gene Ge

20、ne有用基因有用基因 许多转座子中，它的侧翼序列本身就许多转座子中，它的侧翼序列本身就是插入序列是插入序列由转座子介导的转座由转座子介导的转座 免疫球蛋白重链基因免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（由一组可变区基因（V VH H）和）和一组恒定区基因（一组恒定区基因（C CH H）构成，通过这些基因的选择性）构成，通过这些基因的选择性转座和重组转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。白重链，以对付不同的抗原。第第 二二 节节 重组重组DNADNA技术技术DNA Recombination Technique n基因重组基因重组

21、 是指是指DNADNA片段在细胞内、细胞间，甚至片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。具有复制和表达的功能。n 广泛的分为三个水平：广泛的分为三个水平：整体水平（如整体水平（如 生物有性杂交）生物有性杂交）细胞水平（如细胞水平（如 单克隆抗体技术）单克隆抗体技术）分子水平（如分子水平（如 构建重组体）构建重组体）克隆克隆(clone)(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)(clonin

22、g)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一）DNADNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(即即DNA DNA 克隆克隆 )细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNADNA）与载体）与载体DNADNA接合成一具有自我复接合成一具有自我复制能力的制能力的DNADNA分子分子复制子复制子(replicon(replicon)，继而，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因通过转化或转染

23、宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一D N AD N A 分 子，也 称分 子，也 称 基 因 克 隆 或 重 组基 因 克 隆 或 重 组 D N A D N A(recombinant DNA)(recombinant DNA)。定义定义DNADNA克隆克隆生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工

24、程(genetic engineering)(genetic engineering)实实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称程，又称重组重组DNADNA工艺学工艺学。（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n DNADNA聚合酶聚合酶n 逆转录酶逆转录酶n T4DNAT4DNA连接酶连接酶n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶n TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割

25、DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键，使使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，第二链合成，双链双链

26、DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease(restriction endonuclease,RE),RE)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶:是识别是识别DNADNA的特异序

27、列的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链并在识别位点或其周围切割双链DNADNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G GBam Bam HH定义定义、基因工程技术中常用基因工程技术中常用型，型，特点是识别位点与切割位点一致特点是识别位点与切割位点一致分类分类与甲基化酶共同构成细菌的限制修与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNADNA，保护自身保护自身DNADNA。作用作用第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细

28、菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口钝性末端钝

29、性末端粘性末端粘性末端来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功异源酶同功异源酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNADNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为称为同尾酶同尾酶。这两个相同的粘性末端称为。这两个相同的粘性末端称为配配伍末端伍末端(compatible end)(compatible end)。GGATCC

30、CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A同尾酶同尾酶（三）目的基因（三）目的基因n cDNAcDNA(complementary DNA)(complementary DNA)n基因组基因组DNA(genomic DNA)DNA(genomic DNA)（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNADNA噬菌体噬菌体DNADNA等等等等克隆载体克隆载体(cloning ve

31、ctor)(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列被扩增而特意设序列被扩增而特意设计的载体称为计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列可转录翻译成多序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。载体的选择标准载体的选择标准n能自主复制；能自主复制；n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；和鉴定；n有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNADNA插入

32、点），常具有多个单一插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；酶切位点，称为多克隆位点；n分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。n生物安全生物安全1.1.质粒质粒 (plasmid)(plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统 gtgt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNAcDNA克隆）克隆）EMBLEMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.2.噬菌体噬菌

33、体(phage)(phage)M13M13噬菌体噬菌体DNADNA改造系统（含改造系统（含lacZlacZ基因）基因）M13mpM13mp系列系列pUCpUC系列系列含有的含有的lacZlacZ基因编码了基因编码了半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的片段片段（N N端），插入外源端），插入外源DNADNA后，后，片段不能正常合成片段不能正常合成3.3.柯斯质粒柯斯质粒(cosmidcosmid)一种人工构建的一种人工构建的克隆载体，包含了克隆载体，包含了噬菌体的噬菌体的coscos基因。柯基因。柯斯质粒能被包装到斯质粒能被包装到噬菌体粒子中，感染噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入大肠杆菌；它携带入宿主细

34、菌的宿主细菌的DNADNA片段片段（超过（超过45kb45kb）要比质）要比质粒载体携带的要大粒载体携带的要大酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome,BAC)(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNADNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他二、重组二、重

35、组DNADNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNADNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.1.化学合成法化学合成法2.2.基因组基因组DNADNA文库文库 (genomic DNA library)(genomic DNA library)3.cDNA3.cDNA文库文库 (cDNA library)(cDNA library

36、)4.4.聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)(PCR)*化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列 。一般用于小分子基因的合成一般用于小分子基因的合成组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌*从基因组从基因组DNADNA文库文库获取目的基因获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂

37、右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库基因组基因组DNADNA文库（文库（genomic DNA librarygenomic DNA library）将某一基因组将某一基因组DNADNA用适当的限制酶切断用适当的限制酶切断后，与载体后，与载体DNADNA重组，再全部转化宿主细胞，重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所

38、携带的所有存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组基因组DNADNA的集合的集合称为称为G G文库文库cDNAcDNA文库文库(cDNA(cDNA library)library)：以某种细胞的全部以某种细胞的全部mRNAmRNA为模板，利用为模板，利用逆转逆转录酶合成与录酶合成与mRNAmRNA互补的互补的DNADNA（cDNAcDNA）再复制成再复制成双链双链cDNAcDNA,与适当的载体连接后与适当的载体连接后转化入受体菌，转化入受体菌，得到含得到含全部表达基因全部表达基因的种群，称为的种群，称为C-C-文库文库(cDNA(cDNA library)library)。C-C-文库具有

39、组织细胞特异性文库具有组织细胞特异性。如已知目的基因两如已知目的基因两端的序列，则可采端的序列，则可采用 聚 合 酶 链 反 应用 聚 合 酶 链 反 应（PCRPCR）技术，在）技术，在体外合成目的基因。体外合成目的基因。但此法可能会造成但此法可能会造成克隆的目的基因碱克隆的目的基因碱基序列的改变。基序列的改变。利用利用PCR合成合成：（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式方式：(1)(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆

40、载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切

41、位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2.2.平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产

42、生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3.3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在在末端转移酶末端转移酶(terminal transferase(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNADNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶

43、或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA3 5-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体4.4.人工接头人工接头(linker)(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTC

44、G GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)(competent)导入方式导入方式转化转化 (transformation)(transformation)转染转染 (transfection(transfection)感染感染 (infection)(infection)（四）重组（四）重组DNADNA导入受体菌导入受体菌感受态细胞：受体细胞经处理后处于最适摄取和容忍感受态细胞：受体细胞经处理后处于最适摄取和容忍重组体的状态。重组体的状态。（五）重

45、组体的筛选（五）重组体的筛选 1.1.直接选择法直接选择法针对基因设计的筛选方法针对基因设计的筛选方法(1)(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)(2)标志补救标志补救(marker rescue)(marker rescue)(3)(3)分子杂交法分子杂交法 原位杂交原位杂交 SouthernSouthern印迹印迹2.2.免疫学方法免疫学方法针对表达的产物设计的方法针对表达的产物设计的方法如：免疫化学方法及酶免检测分析等如：免疫化学方法及酶免检测分析等(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷

46、酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成 DNADNA重组体重组体标志补救标志补救 互补的检测互补的检测标志补救标志补救原原位位杂杂交交Southern印迹印迹鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因

47、组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达优点：优点：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点缺点：缺点：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNADNA不能加工

48、表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body)(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白1.1.原核表达体系原核表达体系 （E.coliE.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNAcDNA及真核基因组及真核基因组DNADNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济转染转染 将表

49、达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程 磷酸钙转染磷酸钙转染DEAEDEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.2.真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞 方法的选择决定方法的选择决定于细胞的种类、特性于细胞的种类、特性及表达载体的性质及表达载体的性质表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系三、重组

50、技术与医学的关系（二）生物制药（二）生物制药 重组重组DNA医药产品医药产品产 品功 能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱基因诊断基因诊断(genetic diagnosis)(genetic diagnosis)是