干扰RNA文库在功能基因筛选中的应用课件.ppt

1、RNARNA干扰文库及其应用干扰文库及其应用 RNAi的概况 SiRNA类型 RNAi文库（RNAi library)RNAi文库的分类 RNAi文库的构建策略 RNAi文库在功能基因组研究中的应用 RNAi library技术需要注意的问题RNAiRNAi概况概况 RNAi(RNA interference，RNA干扰)：短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基因沉默（gene silence)的现象。因此，又称为knockdown。1995年，康乃尔大学的Su Guo用反义RNA技术抑制par-1基因时，意外发现正义RNA（sense RNA）也能

2、抑制C.elegans par-1基因表达。1998年，Andrew Fire和Craig Mello揭示正义RNA抑制基因表达是由于混有双链RNA。RNAi现象普遍存在动植物体内。发现植物中的21-25nt的RNA分子诱导PTGS（post-transciption gene silence，转录后基因沉默）。2001年，Emily等在果蝇中确定了降解dsRNA的关键酶，并命名为Dicer，此酶属于RNaseIII家族，在进化上保守。SiRNA的类型 寡核苷酸SiRNA：人工合成、体外转录o 特点：易于设计、合成昂贵、瞬时表达 吗啡啉核苷SiRNA：人工合成RNA类似物。o 特点：结合力强，

3、不易降解，效率高 载体表达型SiRNA（细菌质粒、病毒载体）：基于表达载体在细胞内表达。o 特点：稳定表达、可大量扩增，转染效率低，操作繁杂RNAiRNAi的机制的机制 细胞自然存在二种干扰RNAo siRNA（短干扰RNA）：19-25nt，由长dsRNA裂解而成的小片段，诱导mRNA降解。o microRNA(miRNA)：22nt，呈短发夹结构（short hairpin RNA，shRNA），由miRNA前体酶解而成，抑制mRNA翻译。线虫晚期线虫晚期miRNA的的形成形成早期胚早期胚胎发育胎发育过程中过程中miRNAmiRNA参参与细胞与细胞分化分化病毒或病毒或基因重基因重组组siR

4、NAsiRNA的形成的形成及作用及作用 RNAiRNAi 的基本过程：的基本过程：siRNAsiRNA形成：形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量；RISCRISC（RNA-induced silencing complexRNA-induced silencing complex）形）形成：成：与RNAi辅助蛋白argonaute家族分子、RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能量；RISC RISC 活化：活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式；阻止翻译或诱导阻止翻译或诱导mRNAmRNA降解：降解：在siRNA引导下，RISC识别并切割互补的

5、靶RNA，无需或消耗少量ATP。RNAiRNAi library library 人工构建的一系列能对众多基因表达进行干扰的siRNA或shRNA文库。RNAi library分类 已知基因RNAi libraryo 基因家族RNAi libraryo 信号通路RNAi libraryo 结构域RNAi library 全基因组RNAi library 随机序列RNAi libraryRNAiRNAi library library的构建策略的构建策略三种方案o 化学合成o 体外转录o 体内生物合成（采用RNA转录载体）（一）化学合成（二）体外转录 体外转录合成siRNAo 以人工合成的寡DN

6、A片段为模板o 以cDNA基因为模板（三）体内转录合成 用RNA转录载体（质粒、病毒载体）构建RNAi library 通常采用Pol III启动子 U6或H1作为启动子 Pol III启动子特点：o 总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，o 遇到45个连续的U即终止，非常精确。（五）RNAi library的形式 双启动子互补形式 串联形式（tandem type）发夹形式（harpin type）siRNAsiRNA文库（双启动子互补）文库（双启动子互补）（四）构建方法1、根据靶基因序列，人工合成序列特异DNA片段插入到RNA表达载体2、体外合成随机简并DNA片段插入到表达载

7、体中3、REGS（restriction enzyme generated siRNA)方法：cDNA片段文库两端接上限制性酶切位点，插入到表达载体中（常采用BsmB1、BspM1酶。4、miRNA前体序列替换方法shRNAshRNA文库（特异文库（特异DNADNA序列法）序列法）siRNAsiRNA文库（随机序列法）文库（随机序列法）REGSREGS法法miRNAmiRNA前体序列替换方法前体序列替换方法 发夹结构SiRNA的抑制效率比串联结构的SiRNA的效率更高 但发夹结构SiRNA存在二个严重的问题o 一是更难设计发夹结构序列o 二是有20-40%的发夹结构在细菌中会发生碱基突变MIY

8、AGISHI M and TAIRA K的研究结果如何确定作用靶序列如何确定作用靶序列RNAiRNAi的特点：的特点：SiRNA的效率取决于mRNA序列 随机SiRNA只有20-40%有较好的效果 对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。多种因素会影响SiRNA的效率，有必要建立靶序列的运算法则设计原则：设计原则：GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。避免在5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs)设计siRNA 选用靶基因特异且保守的

9、序列 SiRNA的特异性取决于靶序列的特异性，与其他同源基因超过3nt/21nt差异，就有较高的特异性。少于1nt/21nt差异，有非特异作用 设计阴性对照siRNARNAi library的应用 基因功能分析 胚胎发育与干细胞基因调控研究 细胞增殖与分化基因调控研究 细胞生长与转移基因调控 多基因疾病发病机制研究 表观遗传学分析（RNAi可诱导基因甲基化）信号通路新分子的筛选与鉴定 寻找新的药物靶标、基因治疗 药物作用机制探讨应用RNAi library技术需要注意的问题 了解各种RNAi library的优缺点 选择合适的研究对象和目标 建立准确、客观的生物体或细胞形态、结构、功能改变的判别指标，科学评判RNAi 的作用效率。建立快速、灵敏、简便的检测方法：形态学、免疫学、生物化学等检测方法；建立高通量的研究技术平台