巯基的化学修饰(医学PPT课件).ppt

1、精品课程精品课程主讲：刘常金主讲：刘常金第二章蛋白质修饰内 容酶蛋白的化学修饰酶蛋白化学修饰的应用蛋白质改造的分子生物学途径酶蛋白的化学修饰酶蛋白侧链的修饰酶蛋白的亲和修饰酶的化学交联酶蛋白侧链的修饰羧基的化学修饰氨基的化学修饰精氨酸胍基的化学修饰巯基的化学修饰组氨酸咪唑基的化学修饰羧基的化学修饰水溶性的碳二亚胺是特异修饰酶的 COOH，也是最普遍的标准方法羧基的甲酯化氨基的化学修饰NH2具有亲核性烷基化：修饰剂有：卤代乙酸、芳基卤（DNFB)、芳香族磺酸（TNBS）烷基化：与醛酮还原烷基化蛋白质序列分析中的 DNS精氨酸胍基的修饰修饰剂具有两个邻位羰基的化合物 例：丁二酮，1，2环己二酮精氨

2、酸胍基的修饰巯基的化学修饰巯基具有很强的亲核性烷基化:基于碘乙酸的荧光试剂 Enzyme-SH+ICH2COOH Enzyme-S-CH2COOH巯基的化学修饰N乙基马来酰亚胺是专一性强的修饰剂，产物在300nm有最大吸收与DTNB,Ellman试剂反应生成二硫键有机汞试剂专一性强，产物在250nm处有最大吸收巯基的化学修饰组氨酸咪唑基的修饰DPC在中性pH下有专一性，产物在240nm处有最大吸收碘代乙酸可修饰不同的N原子组氨酸咪唑基的修饰色氨酸的吲哚基NBS可修饰吲哚基，但酪氨酸干扰HNBB，Koshland专一水溶性差4硝基苯硫氯,Koshland专一性强注意修饰时对巯基保护色氨酸的吲哚基

3、酶的亲和修饰亲和标记 酶的侧链的化学修饰存在着多个同类残基与修饰剂反应的问题，对某个残基的选择性修饰较困难，因此开发了亲和标记试剂。亲和标记酶的位点专一性修饰时根据酶和底物的亲和性，修饰剂不仅具有对作用基团的专一性，而且具有被作用部位的专一性。这类化学修饰称为亲和标记，这类修饰剂称为位点专一性抑制剂。亲和试剂专一性标记在酶的活性部位，使酶不可逆失活，也称专一性抑制剂。化学交联是一类重要的化学修饰交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或蛋白质与其他分子之间发生交联反应。交联剂种类繁多，在长度、氨基酸专一性、交联速度和交联效率不同。最常用的交联剂酶蛋白修饰的研

4、究历史五十年代，主要研究酶的结构和功能的关系七十年代，人为改变天然酶的某些性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造新的活性酶蛋白化学修饰的应用酶蛋白化学修饰的应用酶经过修饰，会产生的变化：提高生物活性 增强在不良环境中的稳定性 针对特异性反应降低生物识别能力解除免疫原性 产生新的催化能力在结构与功能研究中的应用研究酶空间结构确定氨基酸残基的功能测定酶分子中某种氨基酸的数量问题的提出：医药方面：异体蛋白质的抗原性受蛋白质水解酶水解和抑制作用，在体内半衰期短、稳定性差、不能在靶部位聚集，不在最适pH值，影响使用效果生物技术领域：工业用酶遇酸、碱、有机溶剂变性、不耐热、易受产物和抑制剂抑制。在医

5、药和生物技术中的应用酶的表面化学修饰大分子修饰可溶性大分子可通过共价键连于蛋白质表面，形成覆盖层PEG,PVP,PAA,葡聚糖，环糊精，CMC，肝素等分子量50020000u的PEG，是两亲分子，具有生物相容性聚乙二醇修饰蛋白质PEG 修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇聚乙二醇修饰蛋白质例：聚乙二醇修饰的L-天冬酰胺酶降低甚至消除酶的抗原性，提高了抗蛋白质水解的能力，延长体内半衰期，提高药效L-asparaginase(EC.3.5.1.1)抗肿瘤FDA批准的Oncaspar1994年在美国上市，为L-天冬酰胺的PEG螯合物蛋白质改造的分子生物学途径基因突变技术：通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后研究蛋白质功能的一种方法分两类：位点特异性突变和随机突变位点特异性突变通过寡核苷酸介导的基因突变盒式突变或片段取代突变利用聚合酶链反应（PCR）,以双链DNA为模板进行的基因突变寡核苷酸介导的基因突变是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的几种方法：基于抗生素抗性回复的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变 利用PCR产生定点突变随机突变随机突变DNA shuffling技术技术Thanks!