微生物农药-经典课件.ppt

1、 细菌杀虫剂细菌杀虫剂 杀虫抗生素杀虫抗生素 真菌杀虫剂真菌杀虫剂 病毒杀虫剂病毒杀虫剂 原生动物杀虫剂原生动物杀虫剂 微生物杀线虫剂微生物杀线虫剂 微生物农药是利用微生物及其基因产生或表达的各种生物活性微生物农药是利用微生物及其基因产生或表达的各种生物活性成份，制备出用于防治植物病虫害、环卫昆虫、杂草、鼠害，以成份，制备出用于防治植物病虫害、环卫昆虫、杂草、鼠害，以及调节植物生长的制剂的总称。及调节植物生长的制剂的总称。EPA：微生物、转微生物基因的工程植物。：微生物、转微生物基因的工程植物。微生物农药具有以下优点：（1）对病虫害防治效果好，对人畜安全无毒，不污染环境，无残留；（2）对病虫的

2、杀伤特异性强，不伤害天敌和有益生物，能保持生态平衡；（3）生产原料和有效成分属天然产物，它可回归自然，保证可持续发展；（4）可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改造，不断提高性能和质量；（5）多种因素和成分发挥作用，害虫和病原菌难以产生抗药性。4.1 微生物杀虫剂微生物杀虫剂 按杀虫剂的来源，微生物杀虫剂可分为：细菌杀虫剂、细菌杀虫剂、杀虫抗生素、真菌杀虫剂、病毒杀虫剂、原生动物杀虫杀虫抗生素、真菌杀虫剂、病毒杀虫剂、原生动物杀虫剂、昆虫病原线虫制剂和微生物杀线虫剂剂、昆虫病原线虫制剂和微生物杀线虫剂等类型。4.1.1 细菌杀虫剂细菌杀虫剂 细菌杀虫剂主要包括：苏云金芽孢杆菌杀虫剂、球形芽

3、孢杆菌杀虫剂、金龟子芽孢杆菌杀虫剂和缓病芽孢杆菌杀虫剂等。4.1.1.1 苏云金芽孢杆菌（苏云金芽孢杆菌（Bt）苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），是能形成芽孢的革兰氏阳性杆菌，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的、由蛋白质组成的伴胞晶体。Bt对鳞翅目、双翅目、鞘翅目昆虫以及原生动物门、螨类等类群中的一些种类有活性。Bacillus thuringiensis（苏云金芽孢杆菌)Plutella xylostella（小菜蛾）（小菜蛾）Heliothis armigera（棉铃虫）棉铃虫）Mode of action l1901年日本的石渡繁胤分离到猝倒芽孢杆菌l19

4、11年Berliner分离到类似的杆菌，并命名为苏云金芽孢杆菌l1938年第一种商品化的苏云金芽孢杆菌杀虫剂在法国得到应用l二十世纪90年代以来，第二代细胞工程杀虫剂和第三代基因工程杀虫剂相继投入市场（一）苏云金芽孢杆菌的杀虫成分 按其存在的部位，可分为：外毒素：外毒素：该菌在生长过程中分泌到胞外的代谢产物 内毒素：内毒素：亦称为晶体毒素，是以蛋白质晶体结构的形式存在于细胞内，并随芽孢囊的破裂和芽孢的释放而释放到胞外，是主要的杀虫毒素。活性物质活性物质-外毒素（磷脂酶C）：一种热不稳定的对昆虫肠道有破坏作用的酶。-外毒素(thuringiensin)即苏云金素，是一种热稳定的外毒素。通常在营养

5、生长阶段产生并分泌到胞外。-内毒素：伴胞晶体毒素，有一至几种杀虫晶体蛋白组成的特异性的晶格结构。-外毒素：对昆虫的毒力还不确定。ZwA（Zwittermicin A)：一种抗生素物质，对植物病原细菌和真菌有抑菌作用，同时对Bt杀虫晶体蛋白毒素有协同杀虫活性。营养期杀虫蛋白(VIP)：对小地老虎、甜菜夜蛾等昆虫有杀虫活性。芽孢：可增强其他毒素，特别是-内毒素的杀虫活性。（二）杀虫晶体蛋白基因的分类杀虫晶体蛋白基因的分类 1989年 Hofte 和 Whiteley 根据晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同，将已发表的42种晶体蛋白分为5群14亚类。cryI为鳞翅目特异性，cry为鳞翅目和双翅目特异

6、性，cry为鞘翅目特异性，cry为双翅目特异性。cyt基因。1996年，Crickmore为首的著名学者组成的杀虫晶体蛋白基因命名委员会，提出了苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白按氨基酸的序列同源性进行分类的新分类系统。截至到2003年11月，已报道分离292种各种不同的杀虫基因，这些基因被分为42个不同的基因簇。95%（三）重要的亚种和杀虫基因1.库斯塔克亚种（HD-1）和cry1A杀虫晶体蛋白基因：对鳞翅目昆虫有特异性的杀虫活性。大多数含有cry1Aa、cry1Ab和 cry1Ac，其中cry1Ac基因是毒力最高的基因。将cry1Ac基因插入到能在植物维管束定植的内生细菌的基因组中，通过细菌繁殖产

7、生杀虫毒素蛋白，提高对玉米螟的防治效果。2.鲇泽亚种和cry1C基因：鲇泽亚种含有特征性的cry1C基因，是对灰翅夜蛾等害虫毒力最高的基因。3.拟步行甲亚种和cry3A基因：拟步行甲亚种主要用于防治鞘翅目昆虫。该亚种含有cry3A基因，用于重组微生物和转基因植物，防治鞘翅目昆虫。4.以色列亚种和杀蚊毒素蛋白基因：防治伊蚊、库蚊和按蚊等蚊虫。该亚种含有至少cry4A、cry4B、cry11A和cyt1A四个杀虫基因，Cyt1A晶体蛋白对其他基因的产物具有协同杀蚊作用。5.对动植物寄生线虫有毒的基因：主要是cry5和cry6等。杀线虫剂。4.1.1.2 球形芽孢杆菌（球形芽孢杆菌（(Bacillu

8、s sphaericus,Bs）1965年Kellen等首次分离。为好氧的产芽孢细菌，普遍存在于世界各地的土壤和水生环境中，对蚊幼虫特别是库蚊具有高毒力。主要活性成份：自身产生的一至多个具蛋白质晶格结构的伴胞晶体，含有两种主要蛋白质，分别为51kDa和42kDa，单独对幼虫没有毒性，却都是产生毒性所必需的。这种毒素称为二元毒素（binary）。晶体在中肠的碱性pH环境中溶解，二元毒素51kDa和42kDa分别加工成43kDa和39kDa蛋白。毒蛋白结合于中肠上皮细胞，导致幼虫进食受到抑制，最终导致死亡。毒素通过对敏感幼虫细胞中特定蛋白的ADP-核糖基化发挥作用。4.1.1.3 金龟子芽孢杆菌金

9、龟子芽孢杆菌（Bacillus popilliae）各类金龟子科甲虫的病原菌，杀虫机制是通过细菌在血管内的快速繁殖，引起败血症，而使幼虫致死。金龟子芽孢杆菌使用的局限性是宿主太专一，商业化获得芽孢的唯一途径是细菌在金龟子幼虫中生长。杀虫抗生素是指一类由微生物（主要是放线菌）产生的，具有杀虫活性的次级代谢产物，简称“杀虫素”。l大环内酯类抗生素：大环内酯类抗生素：阿维菌素、伊维菌素、埃玛菌素、Spinosad、梅岭霉素、浏阳霉素l聚醚类抗生素：聚醚类抗生素：莫能菌素、盐霉素、马杜拉霉素4.1.2.1 阿维菌素阿维菌素 （Avermectin）阿维菌素是十六元 大环内酯类抗生素R1 R2阿维菌素

10、A1aMe 阿维菌素 A1bMe 阿维菌素 A2aMe 阿维菌素 A2bMe 阿维菌素 B1aH 阿维菌素 B1bH 阿维菌素 B2aH 阿维菌素 B2bH 阿维菌素的结构阿维菌素的结构目标昆虫：阿维菌素对螨类、线虫和昆虫有很高的杀虫活性，其中包括鳞翅目、鞘翅目、半翅目、双翅目、膜翅目和同翅目等有害农作物昆虫。作用机理是：刺激无脊椎动物释放-氨基丁酸抑制神经传导的物质，使寄生虫处于麻痹状态，终至死亡。应用：广泛用于与各种化学农药和生物农药的复配，以加强生物农药的杀虫效果和降低化学农药的使用量。阿维菌素、伊维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐阿维菌素、伊维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、乙酰氨、乙酰氨基

11、阿维菌素、多拉霉素基阿维菌素、多拉霉素4.2.2 浏阳霉素（浏阳霉素（Liuyangmycin，Polynactin）浏阳霉素属大环四内酯类化合物，有A、B、C三个组份，其中C组份的杀螨活性最高。浏阳霉素是一种低毒、低残留的广谱杀螨剂，对环境污染轻微，对天敌昆虫安全，并且对抗性螨类仍然有效。真菌杀虫剂种类很多，其中以白僵菌、绿僵菌、拟青霉的应用面积最大。真菌杀虫剂与其他生物杀虫剂相比，具有某些类似化学杀虫剂的触杀作用，对刺吸式口器的害虫起到独特的防治效果。其缺点是作用比较慢，侵染过程长，效果受环境影响大。4.3.1 白僵菌白僵菌 在分类上丝孢纲丝孢目丛梗孢科白僵菌属（Beauveria），该属

12、有两种：球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和卵孢白僵菌（Beauveria tenella），其中前者较常见。白僵菌的分生孢子粉致病力强，不污染环境，易于培养生产。白僵菌对多种农林害虫具有致死作用，大面积用于防治松毛虫、玉米螟和水稻叶蝉等害虫。4.3.2 绿僵菌绿僵菌 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)分类上属于丛梗孢科，主要用于防治地下害虫、天牛、飞蝗、蚊幼虫等。另外，对蛴螬亦有明显的防治效果，表现出较好的开发利用前景。病毒杀虫剂的应用在微生物杀虫剂中仅次 于Bt和杀虫抗生素。杆状病毒占所有已知感染昆虫病毒的60%以上。应用最多的杆状病毒有核型多角体

13、病毒（NPV）、质型多角体病毒（CPV）和颗粒体病毒（GV）。病毒杀虫剂优点：病毒杀虫剂优点：宿主特异性强，能在害虫群体内流行，持效作用长等明显的特点。病毒杀虫剂缺点：病毒杀虫剂缺点：杀虫范围太窄、生产困难和作用速度较慢等缺点。包涵体：即单个或多个病毒粒子被包围在一个由蛋白质构成的结构中，包涵体作用：有效地保护病毒颗粒不受损伤，并且在离开虫体数年后仍可保持侵染活性。病毒包涵体通常以取食过程进入昆虫的消化管，经碱性昆虫消化液裂解后释放出病毒粒子，这些病毒粒子进一步侵染昆虫体内的各种细胞，直至造成昆虫死亡。核型多角病毒：是世界卫生组织和粮农组织推荐使用的一种生物杀虫剂，它对人、植物和害虫的天敌均无

14、危害，是目前应用最为成功的昆虫病毒。质型多角体病毒：人们发现它不仅能侵染幼虫，而且能经由卵传染给昆虫的子代，这点在病毒的应用上具有十分重要的作用。核型多角体病毒、质型多角体病毒主要用于棉铃虫、小菜蛾和森林害虫尺蠖的防治。蝗虫微孢子虫（Nosema locustae）：是目前唯一商品化的原生动物杀虫剂，可以防治草原蝗虫，可使亚洲小车蝗、宽须蚁蝗、白边痂蝗和皱膝蝗。特点：既能在短时期内迅速压低虫口密度，又能引起流行病，达到长期控制种群的目的。昆虫病原斯氏属（Steinernema）和异小杆属（Heterhabditis）线虫是目前国际上新型的生物杀虫剂。特点：寄主范围广，对寄主主动搜索能力强，特别

15、是对土栖性及钻蛀性害虫，对人畜、环境绝对安全，并有能人工大量培养的优点。作用机理：主要是昆虫病原线虫斯氏线虫属和异小杆线虫属的共生细菌致病杆菌和发光杆菌以线虫为载体侵入昆虫血腔，在昆虫血腔内繁殖，产生毒素，引起昆虫死亡。线虫的危害十分严重，每年给农作物造成相当于1000亿美元的损失。在我国危害农业最严重的是根结线虫和包囊线虫。微生物杀线虫剂主要包括：食线虫真菌 抗生素（如阿维菌素、甲胺基阿维菌素）穿刺巴斯杆菌（Pasteuria）。4.6.1食线虫真菌食线虫真菌 是植物寄生线虫生物防治中极其有用的生物资源。1978年，法国的Cayrol用粗状节丛成功防治双孢蘑菌丝孢线虫（Ditylenchus

16、 myceliophagus）拟青霉(淡紫拟青霉)，采用液固两相法生产活孢子，用于防治大豆孢囊线虫和烟草根结线虫，还可以促进作物的生长，提高产量。机理：较高的杀虫活性，有类似生长素和细胞分裂素的作用。厚垣轮枝霉ZK7：通过液体深层，用于防治烟草根结线虫。穿刺巴斯杆菌（Pasteuria penetrans），可专一性寄生于根结线虫等多种植物寄生线虫，控制有害线虫的虫口密度。该细菌目前不能通过发酵商业化生产，仍然采用活体线虫进行繁殖。根结线虫的发育受穿刺巴斯德氏柄菌的抑制 穿刺巴斯杆菌的芽孢4.2.1 井冈霉素井冈霉素（Validamycin）对水稻纹枯病菌（Pellicularia Sasak

17、ii）有显著防治作用 作用机理：通过影响纹枯病菌菌丝伸长而降低纹枯病菌的致病力，它对纹枯病菌无致死作用，因而不具备对抗性菌的筛选作用。显著优点：显著优点：持效期长，耐雨水冲涮。持效期可长达2030天；一旦被菌丝吸附，雨水难以冲掉。发酵效价高，应用成本低。目前大罐发酵水平，有效组分最高可达1700018000ug/ml未发现抗药性4.2.2 公主岭霉素公主岭霉素 具有广谱抗植物病原菌作用 对禾谷类的黑穗病、水稻恶苗病、稻曲病的防效显著，效果达95%以上;不吸水链霉菌公主岭新变种（Steptomyces ahygroscopicus subsp.gongzulinensis）产生的代谢产物。4.2

18、.3 春雷霉素春雷霉素 特别适用于水稻稻瘟病的防治，也适用于蔬菜、水果、豆类、糖甜菜、咖啡等作物的真菌或细菌病害。白粉病、炭疽病、枯萎病、纹枯病等有很好的防效。又名农抗751，防治作物细菌性病害，如白菜软腐病、黄瓜角斑病、水稻白叶枯病等。目前，利用微生物源开发的微生物除草剂有二类：一类是利用放线菌生产的抗生素除草剂，例如双丙氨膦；另一类是利用病原真菌生产的孢子除草剂。4.3.1 双丙氨膦双丙氨膦 谷氨酰胺合成酶抑制剂，导致植物体内氨的结累常用于非耕地和果园等防除一年生和某些多年生杂草在土壤中的半衰期（DT50）为2030天。左侧是没有喷洒双丙氨膦除草剂的烟草种植物和杂草一起生长的情况；右侧是喷

19、洒后的情况，只留下烟草种植物。图片提供：Monsanto.Col双丙氨膦的制备方法双丙氨膦的制备方法：l 吸水链霉菌 SF-1293 l特殊培养液中28C下振摇96h l培养物离心l滤液用活性炭脱色 l色谱柱分离 l制得双丙氨膦 4.3.2 孢子除草剂孢子除草剂 由杂草病原真菌生产的活孢子和适宜的助剂组成 作用机理：孢子直接穿透寄主表皮，进入寄主组织，产生毒素，使杂草出现病斑并逐步蔓延，破坏植物的正常生长，导致杂草死亡。孢子除草剂的工业化生产 1、液体发酵生产孢子 盘孢菌属，用液体发酵可生产大量分生孢子。不少具开发应用前景的杂草病原菌在液体发酵条件下只产生菌丝体而不能产生孢子 2、液体固体联合

20、发酵生产孢子 先液体发酵生产菌丝体，然后在固体培养基上发酵利用菌丝体生产大量孢子。3、剂型 孢子除草剂的剂型有粉剂和油剂等 举例：Collego的剂型为粉剂，由孢子粉（A）和水合物表面活性剂（B）组成，实际是“一剂二个包装”的组合剂。4.4.14.4.1赤霉素赤霉素 赤霉素是一种天然的植物生长调节剂，调节植物生根、发芽和结果等过程，刺激水稻、棉花和麻类等作物的生长发育，广泛使用于杂交水稻制种、柑桔保果、棉花保铃、蔬菜及幼林的生长。在国际市场几年来，需求量一直维持在25吨以上，价值约10亿美元；我国2000年注册的生产企业有23家，产值约有10亿元，并有大量的出口。l赤霉素是一类四环双萜羧酸化合

21、物l主要活性物质有GA3、GA4、GA7和GA9等l其中GA3是使用的最多的赤霉素成品 l赤霉素发酵效价的提高，一般从两个方面着手：l其一，使用高产稳定的生产菌株，这就要求从现有的生产菌种中出发，通过诱变筛选出更加高产的菌株；l其二，改良或采用新的发酵工艺，使赤霉菌的发酵潜力发挥到极致。l菌种选育l1）.“4303”菌株 l2）.原生质体诱变技术 l1992年，李武军和郑幼霞 l3）.复合诱变 l1997年，赵炎生等，激光和化学复合诱变 l发酵工艺改良l1)国外l上个世纪八十年代以前，营养因素和发酵的机理；目前，合成代谢途径 l2)国内l较少，一般从某个角度论述l工艺流程为液体发酵，大体是：l

22、斜面种子l种子活化l种子培养l大罐发酵l定时取样测定赤霉酸的含量 l产品提取l培养基的选择l包括碳源培养基、氮源和微量元素的选择l目前的工业生产中，大多以淀粉和谷粉l作为碳源l有研究表明，植物油似乎更适合一些：l有利于消泡；l提高发酵罐的装填率；l降低成本；l解除中间产物的抑制图2-1 不同氮源发酵效价的比较02004006008001000120014001不同类别的氮源发酵效价（微克/毫升）花生饼粉菜仔饼粉黄豆饼粉工业用蛋白胨CSL酵母粉鱼粉硝酸铵氯化铵硫酸铵l测定方法l目前赤霉素的测定方法主要有两大类：其一为生物法，其二为理化测定法，如荧光比色法，、溴酸钾滴定法、福林反应法、磷钼杂多酸法以及气相和液相色谱法等 l 赤霉素荧光测定法:不同浓度硫酸与相同份额GA反应所得产物产生的荧光强度不同 脱落酸是具有倍半萜羧酸结构的植物激素。脱落酸的功能：加快花果脱落;促进顶芽休眠;抑制芽鞘、嫩枝、根、胚轴的生长;促进气孔关闭。生产运用：1990，日本TORAY公司开始利用微生物发酵进行脱落酸的规模化生产。我国谭红等报道用葡萄孢（Botrytis）发酵产生的脱落酸。