教学课件：《生物药物分析与检验》.ppt

1、标题标题 生物药物分析与检测生物药物分析与检测 标题标题 第一章第一章 绪论绪论生物药物按来源和生产方法可分为生物药物按来源和生产方法可分为 1、生化药物 2、微生物药物 3、基因工程药物 4、基因药物 5、生物制品按生物药物的化学本质和化学特性分类按生物药物的化学本质和化学特性分类 1、氨基酸及其衍生物类药物 2、多肽和蛋白质类药物 3、酶和辅酶类药物 4、核酸及其降解物和衍生物类药物 5、糖类药物 6、脂类药物 7、细胞生长因子类 8、生物制品类典型生物药物胰岛素典型生物药物胰岛素B链链 A链链A、B链链胰岛素不稳定难吸收胰岛素胰岛素胰岛素六聚体胰岛素六聚体生物药物的性质 1、在化学构成上

2、 2、在药理学上 3、在医疗上 4、生产制备过程中的特性 5、检验上的特殊性 氨基酸的生产：蛋白质水解，盐酸水解迅速、完全，色氨酸被破坏，丝氨酸部分破坏；碱水解易产生消旋作用；酶水解不完全。发酵法，从发酵液中提取。分离方法：沉淀法（溶解度差异），吸附法（吸附能力差异），离子交换法（所带电荷不同）。药物分析与生物药物分析生物药物分析与检验的特点生物药物分析与检验的特点 1、需进行相对分子质量的测定 2、需要检查生物活性 3、需做安全性检查 4、需做效价测定 5、要用生化法确证结构生物药物分析与检验的基本程序及内容 1、药物的取样 2、药物的鉴别试验 3、药物的杂志检查 4、药物的安全性检查 5、

3、药物的含量（效价）测定 6、检验报告的书写生物药物常用的定量分析方法生物药物常用的定量分析方法 1、酶法 酶活力测定法 酶法分析 2、电泳法 区带电泳 毛细管电泳 薄膜电泳 SDS-聚丙烯酰胺电泳 免疫分析法 放射免疫分析法 酶联免疫分析法 荧光免疫分析法 3、常用的理化法 比色法 紫外分光光度法 高效液相色谱法 滴定法等 4、生物检定法 药物的效价测定 杂志的限度检测 微量生理活性物质的检测 中药物质的检测生物药物的质量及其控制 1、生物药物质量的重要性与特殊性 2、药典与生物药物的质量标准 3、生物药物的质量控制与管理生物药物的质量标准生物药物的质量标准 中华人民共和国药典记载着各种药品的

4、标准，是一个国家关于药品标准的法典。药典和其他法令一样具有约束力。我国先后出了九版药典，1953,1963,1977,1985,1990,1995,2000,2005,2010 从2005年版开始，全书分为三部 第一部收载药材、饮片、中成药及单味制剂；第二部收载化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品及其各类制剂和药用辅料；第三部收载生物制品，首次将中国生物制品规程并入药典。目前世界上已有数十个国家编订了国家药典，在药物分析中可供参考的国外药典主要有：1、美国药典（The United States Pharmacopoeia,USP),2、美国国家处方集（The National Formul

5、ary,NF),3、英国药典（British Pharmacopoeia,BP),4、日本药局方（Pharmacopoeia of Japan,JP),5、欧洲药典（Ph.Eur),6、国际药典(Ph.Int.)生物药物质量控制与管理 对药品质量控制的全过程起指导作用的法令性文件有：GLP;GMP;GSP;GCP。：良好药品实验研究规范；：良好药品生产规范；：良好药品供应规范；：良好药品临床试验规范。：分析质量管理六、国内外生物药物发展概况 1何谓：生物药物？何谓：生物药物？2生物药物质量控制规范有哪些？生物药物质量控制规范有哪些？3与化学合成药物的分析相比，生物与化学合成药物的分析相比，生物

6、 药物的分析有何特点？药物的分析有何特点？4.生物药物的特点。生物药物的特点。5.生物药物常用的定量分析方法。生物药物常用的定量分析方法。标题标题 第二章第二章 酶分析法酶分析法生物催化剂生物催化剂(biocatalyst)n 核酶核酶(ribozyme)：具有高效、特异催化作：具有高效、特异催化作用的核酸，主要参与用的核酸，主要参与RNA的剪接。的剪接。n酶酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的生物分子。具有高效催化作用的生物分子。酶的化学本质固定化酶的制备 吸附法 偶联法 交联法 酶活力测定：以酶做为分析对象 酶分析法 酶法分析：以酶作为分

7、析工具酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质。它在体内含量极微，每质。它在体内含量极微，每ml仅为仅为pg水水平，要直接测定其绝对量是十分困难的，平，要直接测定其绝对量是十分困难的，目前是根据其催化反应速度来定量，称目前是根据其催化反应速度来定量，称为相对定量法。为相对定量法。酶活力测定的基本知识酶活力测定的基本知识几个有关名词几个有关名词 底物底物(substrate,S)：酶作用的物质。：酶作用的物质。产物产物(product,P)：反应生成的物质。：反应生成的物质。酶促反应：酶催化的反应。酶促反应：酶催化的反应。酶活性：酶催化化学反应的能力。酶活性：酶

8、催化化学反应的能力。-酮戊二酸转氨酶丙酮酸Ala+Glu （一）酶活力的概念（一）酶活力的概念 酶活力是指在规定酶活力是指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量。生成量。即酶反应的速度。即酶反应的速度。如果在酶反应过程中测得的产物如果在酶反应过程中测得的产物P或底或底物物S的变化量对时间作曲线可得到酶促反应的变化量对时间作曲线可得到酶促反应时间进行曲线。时间进行曲线。反应最初阶段，反应最初阶段，S过量，原始浓度过量，原始浓度很大。很大。P或或S的变化量随反应时间而线的变化量随反应时间而线性地增减，即单位时间内性地增减，即单位时间内P或或S的变化

9、的变化量或反应速度是恒定的，此阶段称为量或反应速度是恒定的，此阶段称为零级零级反应期反应期。一般情况下，产物和底物的变化量是一般情况下，产物和底物的变化量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，因产物是从无到有，只要测的减少为好，因产物是从无到有，只要测定方法足够灵敏，准确度很高。定方法足够灵敏，准确度很高。（二）酶活性单位（二）酶活性单位 酶活性大小通常以单位酶活性大小通常以单位来表示，单位是一个人为规定的标准，是指在规来表示，单位是一个人为规定的标准，是指在规定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量

10、，酶单位有三种表示方式。酶单位有三种表示方式。1.惯用单位惯用单位 60年代前，各种酶活力的表示年代前，各种酶活力的表示法和酶单位定义没有统一标准，一般由方法的设法和酶单位定义没有统一标准，一般由方法的设计者自行规定在某一特定条件下生成一定量的产计者自行规定在某一特定条件下生成一定量的产物为一个单位。物为一个单位。这样，同一种酶由于测定方法不同，可有不这样，同一种酶由于测定方法不同，可有不同单位定义，如同单位定义，如ALT的比色测定法有金氏法、穆的比色测定法有金氏法、穆氏法、赖氏法，三种方法原理相同，但单位的定氏法、赖氏法，三种方法原理相同，但单位的定义不同，正常参考范围也不同。义不同，正常参

11、考范围也不同。King法法 每每100ml血清在血清在37与底物作用与底物作用60min，每生成，每生成1mol丙酮酸为一个酶活性单位。丙酮酸为一个酶活性单位。Mokum法法 1ml血清血清37与底物作用与底物作用60min每产生每产生5g丙酮酸为一个酶活性单位。丙酮酸为一个酶活性单位。Reitmen法法 套用套用Karman单位，在规定条单位，在规定条件下（血清件下（血清1ml，反应液总量，反应液总量3ml，25，作用，作用1min内径内径1cm比色杯）测定比色杯）测定340nm波长处，吸波长处，吸光度减少值，每减少光度减少值，每减少0.001为一个酶活性单位。为一个酶活性单位。2.国际单位

12、国际单位 1961年国际生化学会酶年国际生化学会酶学委员会建议使用统一的国际单位（学委员会建议使用统一的国际单位（IU）是指在规定条件下（如是指在规定条件下（如25，最适，最适pH，最，最适适S时）每分钟催化时）每分钟催化1mol底物发生反应底物发生反应的酶量。的酶量。1965年改为年改为30，1972年取消对温度年取消对温度的规定。的规定。缺点：缺点：（1）由惯用单位换等成）由惯用单位换等成IU较麻烦。较麻烦。（2）对分子量不明的底物无法计算其）对分子量不明的底物无法计算其摩尔浓度。摩尔浓度。（3）同一种酶用不同的测定方法，换）同一种酶用不同的测定方法，换算成国际单位后仍不相同。算成国际单位

13、后仍不相同。（三）酶的比活性（三）酶的比活性 是指单位质量的蛋白质所具有某种是指单位质量的蛋白质所具有某种的活性，用酶活性单位的活性，用酶活性单位/mg蛋白质来表蛋白质来表示，比活性是衡量酶纯度的一个指标，示，比活性是衡量酶纯度的一个指标，比活性高，表示酶制剂中杂蛋白的含量比活性高，表示酶制剂中杂蛋白的含量少，酶纯度高。少，酶纯度高。酶学分析是酶学分析是20世纪世纪70年代发展起来的一类年代发展起来的一类检测技术，包括酶活性测定和底物浓度测定两检测技术，包括酶活性测定和底物浓度测定两大类型。酶活性的测定方法包括终点法和连续大类型。酶活性的测定方法包括终点法和连续监测法。监测法。根据酶的时间，酶

14、活性测定分为两种类型。根据酶的时间，酶活性测定分为两种类型。1.终点法终点法（end-paint amalyin）测定酶测定酶反应开始后某一段时反应开始后某一段时间内间内(从从t1t2)产物或产物或底物的总变化量称为底物的总变化量称为终点法。终点法。而而t1和和t2是是反应历程中的两个点，反应历程中的两个点，故又称故又称两点法两点法。优点：优点：简便，测定产物时，酶反应被终简便，测定产物时，酶反应被终止，显色剂的选择只考虑对酶活性的影响，止，显色剂的选择只考虑对酶活性的影响，分光光度计不需保温装置。分光光度计不需保温装置。缺点：缺点：无法了解这段时间的反应是否都无法了解这段时间的反应是否都是零

15、级反应，故难以保证结果的真实性。是零级反应，故难以保证结果的真实性。2.连续监测法（连续监测法（continuoue monitosing）每隔一定时间（每隔一定时间（1060s）连续测定酶反应）连续测定酶反应中产物或底物的变化中产物或底物的变化量称为连续监测法。量称为连续监测法。又称又称动力法或速率法动力法或速率法，终点法的测定两个时终点法的测定两个时间点，该法进行多点间点，该法进行多点连续测定。连续测定。优点：优点：多点测定结果，连接成线，很多点测定结果，连接成线，很容易找到成直线的区段，因而可选择线性容易找到成直线的区段，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，测反应期来计算酶活

16、性，不需终止反应，测定结果较准确。省时、省试剂。定结果较准确。省时、省试剂。缺点：缺点：分光光度计必须有保温装置，分光光度计必须有保温装置，而且而且P或或S应是可直接测定的化合物，如需应是可直接测定的化合物，如需加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响。性是否有影响。三、影响酶活性测定的因素三、影响酶活性测定的因素 （一）样品处理的影响（一）样品处理的影响 1.抗凝剂抗凝剂 某些酶可被抗凝剂抑制，某些酶可被抗凝剂抑制，如如EDTA、草酸盐，可抑制需、草酸盐，可抑制需Ca2+的的AMS和需和需Mg2+的的CK、5NT、ALP等，酸酶活性测定都用等，酸酶

17、活性测定都用血清。血清。2.样品存放时间样品存放时间，各种血清酶稳定性不，各种血清酶稳定性不同，如同，如ACP、CK在室温下迅速失活，在室温下迅速失活，AMS、GGT则很稳定。则很稳定。（二）测定条件的影响（二）测定条件的影响 1.温度温度 温度对酶活性的影响包括两温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加个方面，一方面是温度升高，反应速度加快，同一般化学反应，其关系符合快，同一般化学反应，其关系符合Arrhenius公式公式K=Ae 。另外一方面温度。另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。升高，会发生热变性，使酶活性降低。（1）温度的选择）温度的选择 37反应速度

18、快，单位反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，温时间短，25、30可使单位时间的散热较可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学较难定在较难定在30进行，进行，IFCC建议建议30作为参考方作为参考方法的标准温度。法的标准温度。（2）温度系数）温度系数 将温度每升高将温度每升高10后反应后反应速度相当于原来的倍数，称为温度系数速度相当于原来的倍数，称为温度系数(Q10)。Q10表示温度对反应速度影响的大小。表示温度对反应速度影响的大小。2.pH （1）改变底物的解离状态

19、，影响酶与）改变底物的解离状态，影响酶与底物结合。底物结合。（2）改变酶活性中心必需基因的解离）改变酶活性中心必需基因的解离状态，影响酶活性。状态，影响酶活性。（3）改变酶的三维空间构象，使酶变）改变酶的三维空间构象，使酶变性。性。（4）使亚基解聚）使亚基解聚 3.缓冲液性质缓冲液性质 酶活性下仅受缓冲液酶活性下仅受缓冲液pH影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。应考虑的因素。（1）缓冲液中弱酸的解离数）缓冲液中弱酸的解离数pka必须接近必须接近酶测定时的酶测定时的Ph。如如ALT测定测定pH7.4（磷酸（磷酸pka6.7）LDH测定测定pH

20、8.8，（二乙醇胺，（二乙醇胺pka8.8）ALP测定测定pH10（碳酸（碳酸pka10.32）。）。（2）缓冲液对酶活性无抑制作用，）缓冲液对酶活性无抑制作用，如甘氨酸对如甘氨酸对LDH、ALP有抑制作用。有抑制作用。（3）缓冲液在酶反应体系中不会发）缓冲液在酶反应体系中不会发生降解或破坏。生降解或破坏。（4）缓冲液在可见光区或紫外区没）缓冲液在可见光区或紫外区没有成仅有极低光吸收现象。有成仅有极低光吸收现象。酶与医学的关系酶与医学的关系一、酶与某些疾病发生的关系 皮肤乳白色，毛发淡皮肤乳白色，毛发淡黄或银白色，瞳孔淡黄或银白色，瞳孔淡红，虹膜淡灰或淡红，红，虹膜淡灰或淡红，半透明视网膜缺乏

21、色半透明视网膜缺乏色素。素。酪氨酸酶缺陷白化病 智力低下，智力低下，60%60%患儿患儿有脑电图异常，头发有脑电图异常，头发细黄，皮肤色淡和虹细黄，皮肤色淡和虹膜淡黄色，惊厥，尿膜淡黄色，惊厥，尿有有“发霉发霉”臭味或鼠臭味或鼠尿味。尿味。苯丙氨酸羟化酶缺陷苯丙酮酸尿症胱硫醚合成酶缺陷同型胱氨酸尿症多发性血栓形成，晶体脱位，身多发性血栓形成，晶体脱位，身体瘦长，蜘蛛样指（趾），轻中体瘦长，蜘蛛样指（趾），轻中度智力低下度智力低下二、酶在疾病诊断上的应用原理：原理：酶促反应的底物或产物都没有在适宜波酶促反应的底物或产物都没有在适宜波 长的吸收光，把酶的测定与另一肯定有长的吸收光，把酶的测定与另一

22、肯定有 吸收光变化的酶促反应相连接。吸收光变化的酶促反应相连接。天冬氨酸天冬氨酸 草酰乙酸草酰乙酸 AST（待测）待测）苹果酸酶苹果酸酶（指示酶）（指示酶）苹果酸苹果酸NADH+H+NAD+340nm有有吸收峰吸收峰举例：举例：-酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸340nm无无吸收峰吸收峰酶活性测定与疾病诊断ALT（GPT）肝脏疾患肝脏疾患LDH同工酶谱同工酶谱心肌梗塞、肝癌等心肌梗塞、肝癌等碱性磷酸酶碱性磷酸酶骨与肝脏疾患骨与肝脏疾患酸性磷酸酶酸性磷酸酶前列腺转移癌前列腺转移癌肌酸激酶肌酸激酶心肌梗塞、肌肉疾患心肌梗塞、肌肉疾患 高度特异性的有高度特异性的有 鸟氨酸氨基甲酰转移酶鸟氨酸氨基甲酰转移

23、酶（OCT），山梨醇脱氢酶（），山梨醇脱氢酶（SDH），），5-核苷酸酶核苷酸酶（5-NT肝、胆），谷氨酸脱氢酶（肝、胆），谷氨酸脱氢酶（GLDH），淀），淀粉酶（粉酶（AMS胰、唾液腺），丙氨酸氨基转移酶胰、唾液腺），丙氨酸氨基转移酶（ALT、肝、肾、心），肌酸激酶（、肝、肾、心），肌酸激酶（CK、骨髓肌、骨髓肌、心脑），心脑），-谷氨酰转肽酶（谷氨酰转肽酶（-GT或或GGT、肝、胆、肝、胆、肾、小肠）。肾、小肠）。低度特异性的有低度特异性的有 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDH、心、心、肾、骨髓肌、肝、肺）碱性磷酸酶（肾、骨髓肌、肝、肺）碱性磷酸酶（ALP、小肠、小肠、胎盘、肝、肾）。胎盘、肝

24、、肾）。三、酶在疾病治疗中的应用消化酶类消化酶类抗炎清创酶类抗炎清创酶类抗栓酶类抗栓酶类抗氧化酶类抗氧化酶类抗肿瘤细胞生长的酶抗肿瘤细胞生长的酶 美国一位美国一位4岁小女孩岁小女孩Ashanti DiSilva,她患了一种她患了一种严重联严重联合免疫缺陷征（合免疫缺陷征（SCID）的疾病，机体对任何微生物都的疾病，机体对任何微生物都缺乏抵抗力，她只能呼吸过滤了的空气，饮用严格消缺乏抵抗力，她只能呼吸过滤了的空气，饮用严格消毒的水和吃严格消毒的食物。毒的水和吃严格消毒的食物。病因：病因：腺苷酸脱氨酶（腺苷酸脱氨酶（ADA）基因先天遗传缺陷。基因先天遗传缺陷。Dr.W.French Anderso

25、n 和他的同事在和他的同事在 小女小女 孩的孩的T细胞中插入一个正常的细胞中插入一个正常的 ADA基因，将其注入她的血液系统。基因，将其注入她的血液系统。正常的正常的T细胞以每月增长细胞以每月增长25%的速度生的速度生 长，改善了她的免疫功能长，改善了她的免疫功能1990年首次基因疗法固定化酶思考题 1、何谓酶活性，酶活性的检测方法。2、酶法分析中终点测定法与反应速度法有何优缺点？标题标题 第三章第三章 免疫分析法免疫分析法第一节 概述 免疫分析法 是以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法。1959 1959年年，美国美国R.Yallow和和BersonBerson等人：等人：开创性地开创性地

26、 放射性同位素示踪技术的高灵敏性放射性同位素示踪技术的高灵敏性 免疫反应的高特异性免疫反应的高特异性 测定糖尿病人血浆中的胰岛素，从而创立了测定糖尿病人血浆中的胰岛素，从而创立了RIARIA法，法，19771977年年获诺贝尔医学奖。获诺贝尔医学奖。启发：启发：酶免疫分析法酶免疫分析法 EIA化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法CLIA荧光免疫分析法荧光免疫分析法FIA独立学科独立学科用于测定蛋白质、酶等大分子，小分子量药物用于测定蛋白质、酶等大分子，小分子量药物-体内药分的基本技术体内药分的基本技术 免疫分析法在药物分析中的应用：1、在科学研究中；2、测定生物利用度；3、在临床检测中；4、在

27、药物生产中；5、对特定的微量有害杂质。基本条件基本条件 免疫分析必需三种基本试剂：标记抗原、非标记抗免疫分析必需三种基本试剂：标记抗原、非标记抗原和特异抗体原和特异抗体（一）抗原及其制备（一）抗原及其制备1.全抗原与半抗原全抗原与半抗原 2.人工抗原的制备人工抗原的制备 3.人工抗原的鉴定人工抗原的鉴定（二）特异抗体的制备及鉴定（二）特异抗体的制备及鉴定1.特异抗体特异抗体 2.抗体的制备抗体的制备 3.抗体的鉴定抗体的鉴定 第二节 抗原抗原的定义：系指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。人工抗原的合成：药物分子由于相对分子量较小，其免疫原性弱，故通常认为是半抗原。为了得到高效价的抗血清，

28、通常要将其制成合成抗原。第三节 抗体 抗体：是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白，通常由两条相同的重链和两条相同的轻链所组成。抗体具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原起专一的反应。抗体示意图第四节、免疫分析法及其应用 免疫分析法 具有灵敏度高、选择性强的特点。已广泛应用于科学研究、药物分析、临床检验、环境监测等多个领域。一、方法分类按标记物的种类按标记物的种类按是否加入分离剂按是否加入分离剂放射免疫分析法放射免疫分析法酶免疫分析法酶免疫分析法化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法荧光免疫分析法荧光免疫分析法均相免疫分析均相免疫分析-EMIT、FPIA非均相免疫分析非均相免疫分析

29、RIAEIACLIAFIA方法分类方法分类 放射免疫分析放射免疫分析 RIARIA定义：将放射性同位素示踪技术的高灵敏性与定义：将放射性同位素示踪技术的高灵敏性与免疫反应的高特异性相结合的免疫分析方法。免疫反应的高特异性相结合的免疫分析方法。一、放射性同位素标记抗原一、放射性同位素标记抗原常用的放射性同位素有：常用的放射性同位素有：3H、14C、125I、131I半衰期：半衰期：3H 12.3年；年；14C 5700年；放射性废料年；放射性废料 处理困难。处理困难。131I仅仅8天，天，125I 60天天目前多用目前多用3H、125I 3H发射的发射的射线能量较低，要用价格较贵的液体闪射线能量

30、较低，要用价格较贵的液体闪烁计数器检测；烁计数器检测；125I衰变发射的衰变发射的-射线能量较高，可用一般的射线能量较高，可用一般的-射线计射线计数器检测。数器检测。放射免疫测定中结合或游离放射物质的分离 分离结合或者游离的放射物质，进而进行测定是放射免疫分析的关键。二、F与B的分离技术 a.对分离方法的要求：使结合部分（B）与游离部分（F）尽可能分离完全 分离后便于放射性测量 分离效果不受外界干扰因素的影响 操作简便、分离迅速、重复性好 与游离标记物的非特异性结合尽可能小 试剂来源广泛、价格低廉 b.常用的分离方法 沉淀法：抗体为蛋白，常用蛋白沉淀剂 -硫酸铵 吸附法：固体吸附剂吸附游离抗原

31、，有 DCC、纤维素、硅酸盐等。固相法：抗原、抗体结合物B附在固相载体表面，游离抗原F在反应液中。双抗体法：第二抗体沉淀可溶性抗原-抗体结合物，离心分离。三、放射性免疫测定仪（1）125I、131I射线，计数器（2）3H、14C射线，液体闪烁测量仪放射免疫分析的临床应用放射免疫分析的临床应用临床常用近临床常用近 200 种种（1）肿瘤相关抗原的测定：）肿瘤相关抗原的测定：AFP、CEA、CA199、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA 等等（2）激素的测定：）激素的测定：下丘脑下丘脑-垂体垂体-甲状腺轴激素，下丘脑甲状腺轴激素，下丘脑-垂体垂体-性腺轴性腺轴激素，下丘

32、脑激素，下丘脑-垂体垂体-肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲状旁腺素与降钙素，生长激素等状旁腺素与降钙素，生长激素等（3）非激素蛋白质的测定：）非激素蛋白质的测定：铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、肌红蛋白、血栓素、肌红蛋白、血栓素、III 型前胶原肽、层黏蛋白等型前胶原肽、层黏蛋白等（4）酶的测定：）酶的测定：前列腺酸性磷酸酶、前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE 等等（5）药物及维生素的测定：）药物及维生素的测定：地高辛、叶酸、地高辛、叶酸、VitB12 等等（6）免疫分子的测定：）免疫分子的测定：各种各种

33、 Ig、抗、抗 DNA、IL、CD、CIC（7）病原学研究：）病原学研究：现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定的价值的价值（8）其它：）其它：甘胆酸、透明质酸等甘胆酸、透明质酸等五、方法评价RIA是最早建立的免疫分析方法是最早建立的免疫分析方法优点：灵敏度高、特异性强、取样量少、适优点：灵敏度高、特异性强、取样量少、适用于大批量样品的测定。用于大批量样品的测定。缺点：放射性同位素危害健康、污染环境；需专缺点：放射性同位素危害健康、污染环境；需专用的同位素实验室及测量仪器，成本高，现用的同位素实验室及测量仪器，成本高，现少用少用 酶免疫分析法酶免疫

34、分析法 EIAEIAEIA是以酶作为标记物的免疫测定方法。是以酶作为标记物的免疫测定方法。与与RIARIA的不同之处是用具有高效专一催的不同之处是用具有高效专一催化特性的标记酶代替放射性同位素标记物。化特性的标记酶代替放射性同位素标记物。用酶和底物的化学反应作为放大系统，提用酶和底物的化学反应作为放大系统，提高灵敏度高灵敏度均相酶免疫分析均相酶免疫分析-常用常用 非均相免疫分析非均相免疫分析常用酶常用底物 反应 颜色1、辣根过氧化物酶（HRP）H2O2不溶性供氢体：3，3-二氨基联苯胺（DAB）黄褐色可溶性供氢体：3-邻苯二胺（OPD）橙色2、碱性磷酸酶对硝基酚磷酸盐（无毒性）黄色3、葡萄糖氧

35、化酶与HRP类似棕色常用的标记酶及底物常用的标记酶及底物一、酶标记抗原一、酶标记抗原酶标药物的制备考虑原则对酶和抗体的活性无影响或影响很小对酶和抗体的活性无影响或影响很小生成的结合物是可溶性的，稳定的生成的结合物是可溶性的，稳定的反应条件容易控制反应条件容易控制制备方法应简单、重复性好制备方法应简单、重复性好制备方法与人工抗原的准备方法类似制备方法与人工抗原的准备方法类似均相免疫分析均相免疫分析 在某些免疫分析中，当抗原在某些免疫分析中，当抗原-抗体反抗体反应达到平衡后，反应液中结合的标记药应达到平衡后，反应液中结合的标记药物与游离的标记药物之中物与游离的标记药物之中有一种不产生有一种不产生信

36、号或信号消失，因此无需信号或信号消失，因此无需将反应液分将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行测定，作两相，即可在均相溶液中进行测定，故称为均相免疫分析。故称为均相免疫分析。是指酶标抗原是指酶标抗原(AgE)同抗体同抗体(Ab)结合后，所形成的酶结合后，所形成的酶标抗原标抗原-抗体结合物抗体结合物(AgE-Ab)可使酶的活性发生改变可使酶的活性发生改变(增强或减弱增强或减弱)，且（因而）不需将游离的酶标药物，且（因而）不需将游离的酶标药物(AgE)与结合的与结合的(AgE-Ab)酶标药物分开，就可直接通过酶标药物分开，就可直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。测定酶活性的变化，求出样品

37、含量的方法。该法最大的特点是不必将结合部分和游离部分分开，不需温育，便可直接用分该法最大的特点是不必将结合部分和游离部分分开，不需温育，便可直接用分光光度计测定其吸收度。光光度计测定其吸收度。其代表是酶增强（放大）免疫测定技术（其代表是酶增强（放大）免疫测定技术（Enzyme Multiplied Immunoassay Technique,EMIT）三、非均相三、非均相EIA 在此法中，酶标抗原在此法中，酶标抗原-抗体结合物与游离的酶标抗体结合物与游离的酶标抗原均有酶活性，需将二者分离后才能测定。抗原均有酶活性，需将二者分离后才能测定。常用的分离方法是固相法，现通常被称为酶联免常用的分离方法

38、是固相法，现通常被称为酶联免疫吸附测定（疫吸附测定（Enzyme linked Immunosorbent Assay,ELISA）ELISA简介简介 1971年瑞典学者年瑞典学者 Engvall 和和Perlmann，荷兰学者，荷兰学者Van Weeman和和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（为酶联免疫吸附实验（ELISA）ELISA原理原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免

39、疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关 ELISA原理图原理图ELISA基本的实验过程基本的实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色ELISA基本的实验过程基本的实验过程 举例：了解利用双抗体夹心法测定甲胎蛋举例：了解利用双抗体夹心法测定甲胎蛋白（白（AFPAFP）的方法）的方法实实验材料AFP

40、AFP诊断试剂盒诊断试剂盒AFPAFP阳性品，阴性对照品，待检品阳性品，阴性对照品，待检品微量加样器微量加样器标记笔标记笔 实验步骤实验步骤1.将包被孔编号，分别加入阳性对照、阴性对照及待测样品各100ul，37温育30分钟2.各孔分别加入洗涤液2滴，摇匀，弃去，用蒸馏水或自来水加满各孔甩掉，反复5次，然后在吸水纸上吸干（倒扣在吸水纸上）3.在各孔内加入酶结合物2滴，37温育15分钟4.重复步骤25.各孔内加入底物1滴，随即加入显色剂1滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应25min，观察结果结果判定结果判定若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为阴性若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性若待检孔显

41、色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性临床意义临床意义可以用作原发性肝癌的大规模普查可以用作原发性肝癌的大规模普查 阴阴 性性:一般不考虑一般不考虑 弱阳性弱阳性:建议动态观察建议动态观察.阳阳 性性:结合病史、临床症状及体结合病史、临床症状及体症等综合判断症等综合判断可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤四、方法评价四、方法评价优点：对人体无放射性伤害、不污染环境优点：对人体无放射性伤害、不污染环境,标记物稳定，半衰期？可超过一年，标记物稳定，半衰期？可超过一年，均相均相EIA可直接测定，可直接测定，信号用普通的分光光度计测定，价廉。信号用普通的分光光度计测定，价廉

42、。缺点：缺点：不像同位素、荧光可直接产生信号，需加不像同位素、荧光可直接产生信号，需加入底物、辅酶进行酶反应后测定。入底物、辅酶进行酶反应后测定。化学发光免疫分析化学发光免疫分析 CLIACLIA定义：是将化学发光反应（氧化反应）的高灵敏度高灵敏度和免疫反应的高度专一性高度专一性结合起来，用于测定超微量物质的一种检测技术。一、原理一、原理化学发光反应化学发光反应是利用某些特定的化学反应所产生的能量使其产物或反应中间态分子激发，形成电子激发态分子，当这种激发态分子回到稳定的基态时所释放出的化学能量能以可见光的形式发射。能产生化学发光反应的物质称为化学发光能产生化学发光反应的物质称为化学发光剂或化

43、学发光底物。剂或化学发光底物。将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，通过测量发光强度，根据标准曲线得到待测物通过测量发光强度，根据标准曲线得到待测物的浓度。的浓度。二、化学发光免疫分析的类型 （一）直接化学发光物质标记法（二）（二）化学发光酶免疫分析法化学发光酶免疫分析法鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物作为酶的发光底物鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物作为酶的发光底物发光增强剂发光增强剂三、方法评价三、方法评价1.与与RIA相比，不用放射性物质，不污染环相比，不用放射性物质，不污染环境，不危害健

44、康；且准确性、重复性好，线境，不危害健康；且准确性、重复性好，线性范围宽，更适合定量分析。性范围宽，更适合定量分析。2.与与FIA相比，不易受自然荧光或生物样品中相比，不易受自然荧光或生物样品中基体荧光的干扰，可得到较高的信噪比。基体荧光的干扰，可得到较高的信噪比。3.使用增敏化学发光液为底物，大大提高灵敏度使用增敏化学发光液为底物，大大提高灵敏度因此，本法具有广阔的应用前景因此，本法具有广阔的应用前景 荧光免疫分析 FIA 书书：FIA是以荧光物质作为标记物与是以荧光物质作为标记物与待测物待测物结合，所结合，所形成的荧光标记药物能与抗体发生免疫反应，引起形成的荧光标记药物能与抗体发生免疫反应

45、，引起荧光荧光强度发生变化强度发生变化的一种分析方法。的一种分析方法。荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。以发射光形式释放出能量，称为荧光。是以小分子的荧光物质标记抗原或抗体，将抗原抗是以小分子的荧光物质标记抗原或抗体，将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。或超微量物质进行

46、定量测定。灵敏度高，无辐射伤害，无环境污染，易自动化灵敏度高，无辐射伤害，无环境污染，易自动化荧光免疫测定荧光免疫测定均相荧光免疫测定均相荧光免疫测定（易实现自动化操作，在体内药物分析中主要用此法）（易实现自动化操作，在体内药物分析中主要用此法）非均相荧光免疫测定非均相荧光免疫测定（heterogeneous fluorescence heterogeneous fluorescence immunoassayimmunoassay）一、荧光标记物1.具有同待测药物连接的活性基团，连接后的具有同待测药物连接的活性基团，连接后的标记药物同抗体结合后，其荧光性质最好能标记药物同抗体结合后，其荧光性

47、质最好能发生改变。发生改变。2.稳定，并具有较高的荧光效率；稳定，并具有较高的荧光效率；3.药物上的抗原决定簇不能被覆盖药物上的抗原决定簇不能被覆盖 荧光标记物的基本要求荧光标记物的基本要求常用荧光标记物：常用荧光标记物：荧光素荧光素 罗丹明罗丹明二、荧光免疫分析的类型I.底物标记荧光免疫分析底物标记荧光免疫分析II.荧光偏振免疫分析荧光偏振免疫分析III.荧光猝灭免疫分析荧光猝灭免疫分析IV.IV.荧光增强免疫分析荧光增强免疫分析V.时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定 方法评价方法评价 样品用量少样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好重复性好

48、 快速，易自动化快速，易自动化 适于小、中等分子物质检适于小、中等分子物质检 据报道该法测定血清中地高辛的最低浓度据报道该法测定血清中地高辛的最低浓度为为0.2ng/m1；日内；日内RSD小于小于5，日间，日间RSD小于小于7，在，在389天后制作的标准曲线仍与原标准天后制作的标准曲线仍与原标准曲线基本重叠。曲线基本重叠。还有人报道应用不同免疫分析方法与还有人报道应用不同免疫分析方法与HPLC法同时测定同一样本中的苯妥英，只有法同时测定同一样本中的苯妥英，只有FIA法法和和HPLC法相关性较好。另外应用法相关性较好。另外应用FIA法时，无法时，无需分离游离的和结合的荧光标记药物，再加需分离游离

49、的和结合的荧光标记药物，再加上有上有TDx自动分析仪，使得测定非常方便，所自动分析仪，使得测定非常方便，所以以FIA法应用日益普遍。法应用日益普遍。荧光猝灭免疫分析荧光猝灭免疫分析 FQIA定义：定义：是利用游离标记药物具有荧光，当是利用游离标记药物具有荧光，当其与抗体结合之后即失去荧光这一性质来测其与抗体结合之后即失去荧光这一性质来测定样品含量的一种荧光分析方法。定样品含量的一种荧光分析方法。荧光增强免疫分析荧光增强免疫分析 FEIA定义：定义：是利用荧光标记药物与抗体结合之是利用荧光标记药物与抗体结合之后，能使其荧光强度增加的性质来测定样品后，能使其荧光强度增加的性质来测定样品的含量。的含

50、量。免疫分析法的一个共同缺点免疫分析法的一个共同缺点是代谢物的干扰问题！是代谢物的干扰问题！每一种免疫分析方法都需要特殊、专用的仪器每一种免疫分析方法都需要特殊、专用的仪器第五节 免疫扩散法免疫扩散是根据抗原和抗体在琼脂介质中扩散的结果，对其性质进行分析的一种方法。双向免疫扩散双向免疫扩散（Double Immunodiffusion)免疫双向扩散是利用琼脂糖凝胶为介质的一免疫双向扩散是利用琼脂糖凝胶为介质的一种沉淀反应。种沉淀反应。其原理为抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝其原理为抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，在二者比例合适的地方，生胶中扩散相遇，在二者比例合适的地方，生成肉眼可见