应用微生物与免疫学实验实训最全课件整套ppt完整版教学教程全套电子讲义讲义(最新).ppt

1、 实验三、基础培养基的制备实验三、基础培养基的制备 一、目的要求v了解配制培养基的基本程序，熟悉基础培养了解配制培养基的基本程序，熟悉基础培养基的配制原则和制备方法。基的配制原则和制备方法。v掌握肉汤培养基、普通琼脂培养基的制备及掌握肉汤培养基、普通琼脂培养基的制备及用途。用途。二、实验原理二、实验原理v培养基为人工培养微生物而制备的、提供适培养基为人工培养微生物而制备的、提供适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。基质。v人工制造适宜的培养基并给予合适的温度、人工制造适宜的培养基并给予合适的温度、气体等培养条件，即能使细菌等微生物在体气体等培养条件

2、，即能使细菌等微生物在体外迅速生长繁殖。外迅速生长繁殖。三、培养基配制原则：三、培养基配制原则：v（1）目的要明确：目的要明确：根据微生物的种类、培养根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。微生物对培养物质的需求不同。v（2）营养要协调：营养要协调：注意各种营养物质的浓注意各种营养物质的浓度和比例。度和比例。v（3）pH要适宜：要适宜：各种微生物适宜生长的各种微生物适宜生长的pH范围不同。范围不同。细菌细菌pHpH为：为：6.5-7.56.5-7.5；放线菌放线菌pHpH为：为：7.5-8.57.5-8.5；

3、真菌真菌pHpH为：为：5.0-6.05.0-6.0。四、培养基的种类四、培养基的种类v据组成成分可分为据组成成分可分为:1.合成培养基：合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。2.半合成培养基：半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。3.天然培养基：天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。v天然培养基:是用化学成分并不十分清楚或化学成分不是用化学成分并不十分清楚或化学成分不恒定的恒定的天然有机物质配制天然有机物质配制而成培养基。而成培养基。常用的有机物有牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、常用的有机物有牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、麦芽汁、豆芽汁、玉米粉、麸皮、牛奶、血麦芽汁、豆

4、芽汁、玉米粉、麸皮、牛奶、血清等。如实验室常用于培养细菌的清等。如实验室常用于培养细菌的牛肉膏蛋牛肉膏蛋白胨培养基白胨培养基，及培养酵母菌的，及培养酵母菌的麦芽汁培养基麦芽汁培养基等就属于此类培养基。等就属于此类培养基。v从培养基的物理状态可分为从培养基的物理状态可分为:1.液体培养基：液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基。3.半固体培养基：半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。按用途不同分为：按用途不同分为：v1基础培养基基础培养基:含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质

5、。最常用的基础培养基是上面提及的天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培牛肉膏蛋白胨培养基。养基。v2营养培养基（加富培养基）营养培养基（加富培养基）:在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液、血清、血液、血清、酵母浸膏或生长因子酵母浸膏或生长因子等。用以培养对营养要求高的微生物，如培养百日咳杆菌需要含有血液的培养基。在研究致病微生物致病微生物时常采用加富培养基。v3鉴别培养基鉴别培养基:是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。主要用于不同类型微生物的快速鉴定。v4选择培养基选择培养基:利用微生物对某种或某些化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利于所需分离的微生物生长

6、，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的，如分离真菌的马丁氏培马丁氏培养基养基。选择培养基选择培养基v加入青霉素的培养基：加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌v加入高浓度食盐的培养基：加入高浓度食盐的培养基：分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌v不加氮源的无氮培养基：不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌分离固氮菌v不加含碳有机物的无碳培养基：不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物分离自养型微生物v加入青霉素等抗生素的培养基：加入青霉素等抗生素的培养基：分离导入的目的基因的受体细胞分离导入的目的基因的受体细胞v加入氨基嘌呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基：加入氨基嘌呤、

7、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基：分离杂交瘤细胞分离杂交瘤细胞五、培养基配制的一般程序五、培养基配制的一般程序v 称量：称量：按照配方正确称取各种原料放于烧杯中。v 溶化：溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。v 调调pH值：值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。v 加琼脂溶化加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。v 过滤过滤v 分装：分装：注意不要污染棉塞。v 包扎成捆包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。v 灭菌灭菌v 摆斜面摆斜面v 检查：检查：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。按培养基按培养基配方称量配

8、方称量加水加加水加热熔化热熔化调节调节pH值值过滤过滤分装分装包装包装灭菌灭菌检查灭菌检查灭菌彻底与否彻底与否六、实验内容 （一）（一）材料：材料：v药品：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠等。v高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱。v其它：1N NaOH、天平、牛角匙、电炉、pH试纸、烧杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、三角瓶、带棉塞的试管、培养皿、吸管、各种包装纸、绳索、标签等。v5人人/组：组：2 2人配液体培养基，人配液体培养基，2 2人配固体培养基，人配固体培养基，1 1人清洗。人清洗。v器材（每组）：器材（每组）：试管试管1010支（支（2 2支支/人），锥形瓶人），锥形瓶1 1个，烧杯个，烧杯2

9、 2个，分装个，分装装置装置1 1个，培养皿个，培养皿5 5套（套（1 1套套/人）人）（二）配制程序v1、肉汤培养基（、肉汤培养基（不加琼脂不加琼脂，是一种液体培养，是一种液体培养基）配基）配100ml.配方如下：配方如下：牛肉膏牛肉膏 0.30.5g 蛋白胨蛋白胨 1g 氯化钠氯化钠 0.5g 蒸馏蒸馏水水 100mL pH 7.6 灭菌灭菌 103.42kPa，121.3，1520min1N NaOH调节，调节，用试纸测定用试纸测定分装：分装：6ml/管；分装管；分装5支。支。剩余液体再分装剩余液体再分装检查灭菌是否彻底检查灭菌是否彻底配制程序配制程序v2 2、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（、

10、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（加琼脂加琼脂，固体培养，固体培养基），基），配配200ml.200ml.配方如下：配方如下：牛肉膏牛肉膏 1g 1g 蛋白胨蛋白胨 2g 2g 氯化钠氯化钠 1g 1g 琼脂琼脂 6g 6g 蒸馏水蒸馏水 200mL200mL pH 7.6 灭菌灭菌 103.42kPa，121.3，1520min1N NaOH调节，调节，试纸测定试纸测定分装：分装：6ml/管；分装管；分装5支支 剩余液体留在锥瓶，一起灭菌剩余液体留在锥瓶，一起灭菌摆斜面摆斜面检查灭菌检查灭菌是否彻底是否彻底v灭菌物品包括：灭菌物品包括：液体培养基（液体培养基（5 5管管/组）组）固体培养基（固体培养基

11、（5 5管管/组）组）锥瓶剩余培养基（锥瓶剩余培养基（1 1瓶瓶/组）组）培养皿（培养皿（5 5套套/组）组）灭菌后烤箱烘干灭菌后烤箱烘干实验程序实验程序（培养基的灭菌方法）（培养基的灭菌方法）v加压蒸汽灭菌法加压蒸汽灭菌法 其步骤如下：其步骤如下：1.1.灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。封盖。封盖。2.2.接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。3.3.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀。大气后关闭排气阀。4.4.当压力达当压力达15bl/in15bl/in2

12、 2（即（即1.05kg/cm1.05kg/cm2 2）时，此时灭菌器）时，此时灭菌器内的温度为内的温度为1211210 0C C，维持，维持151520min20min。5.5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。思考题思考题v1 1、人工培养细菌的条件是什么？、人工培养细菌的条件是什么？v2 2、制备培养基的一般程序是什么？、制备培养基的一般程序是什么？v3 3、肉汤培养基、肉汤琼脂固体培养基和肉汤、肉汤培养基、肉汤琼脂固体培养基和肉汤琼脂半固体培养基的配方成

13、分有什么区别？琼脂半固体培养基的配方成分有什么区别？这三种培养基各有何作用？这三种培养基各有何作用？项目二 酵母固定化及酒精发酵v一、实验目的一、实验目的v二、实验原理二、实验原理v三、实验材料三、实验材料v四、实验操作四、实验操作一、实验目的1.了解固定化酶和固定化细胞的作用和原理了解固定化酶和固定化细胞的作用和原理。2.掌握利用海藻酸钠制备固定化酵母细胞，掌握利用海藻酸钠制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。二、实验原理二、实验原理v 使用细胞固定化的方法有很多种。工业使用细胞固定化的方法有很多种。工业上常用包埋法固定微生物细胞。根据包埋上

14、常用包埋法固定微生物细胞。根据包埋剂的特性，如海藻酸钠程溶液状，将细胞剂的特性，如海藻酸钠程溶液状，将细胞加入混匀，然后在氯化钙中凝固，凝胶颗加入混匀，然后在氯化钙中凝固，凝胶颗粒中的微小空格将细胞固定，海藻酸钠凝粒中的微小空格将细胞固定，海藻酸钠凝固的颗粒可以反复使用，细胞在空格中可固的颗粒可以反复使用，细胞在空格中可新陈代谢，也可利用细胞中的酶进行酶促新陈代谢，也可利用细胞中的酶进行酶促反应。反应。（二）固定化细胞技术（二）固定化细胞技术1.1.将酶或细胞固定化的方法将酶或细胞固定化的方法将酶（或细胞）包埋在将酶（或细胞）包埋在细微网格里细微网格里将酶（或细胞）相将酶（或细胞）相互连接起来

15、互连接起来将酶（或细胞）吸附在将酶（或细胞）吸附在载体表面上载体表面上包埋法包埋法化学结合法化学结合法吸附法吸附法实验操作实验操作 培养基配制及灭菌培养基配制及灭菌海藻酸钠溶解0.2M CaCl2溶液配制活性酵母固定化接种培养培养基配制培养基配制v蛋白胨蛋白胨10g，葡萄糖，葡萄糖40g，蒸馏水，蒸馏水200ml，装入，装入500ml三角瓶中，三角瓶中，115，灭菌，灭菌15min.0.2M CaCl2溶液配制v称称4.5g CaCl2，加蒸馏水溶解至，加蒸馏水溶解至200ml，混，混匀。匀。海藻酸钠溶解v称称1.25g海藻酸钠，加蒸馏水海藻酸钠，加蒸馏水50ml，搅，搅拌煮沸溶解（在溶解后要

16、，注意补足水分拌煮沸溶解（在溶解后要，注意补足水分，防止海藻酸钠浓度过高，影响细胞固定，防止海藻酸钠浓度过高，影响细胞固定化）冷却，待用化）冷却，待用活性酵母固定化v 在冷却至约在冷却至约40左右的海藻酸钠溶液中加入左右的海藻酸钠溶液中加入5g活性干酵母，搅拌均匀。活性干酵母，搅拌均匀。v 将上述混合液装入灭菌注射器中，再滴入将上述混合液装入灭菌注射器中，再滴入0.2M CaCl2溶液中成珠状。溶液中成珠状。v 固定化的细胞用无菌水或冷开水洗涤固定化的细胞用无菌水或冷开水洗涤23次次。接种培养v取灭菌培养基，冷却，加入青霉素（取灭菌培养基，冷却，加入青霉素（5ug/ml）。）。v将洗涤后的固定

17、化酵母菌倒入培养基中将洗涤后的固定化酵母菌倒入培养基中，混匀，置，混匀，置28恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养 23天。天。实验操作过程中要注意的下列问题实验操作过程中要注意的下列问题（一）加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要（一）加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败，海藻酸钠的的一环，涉及到实验的成败，海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。胞的数目少，影响实验效果。

18、（二）、刚形成的凝胶珠应在（二）、刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。胶珠是成

19、功的。考试内容与要求考试内容与要求1、器皿包扎、器皿包扎:1ml 10ml 吸管吸管2、水样菌落总数测定（操作）、水样菌落总数测定（操作）样品：样品：C样样(10-1)稀释三个梯度（稀释三个梯度（10-1，,10-2,10-3），每个梯度做两个培养皿），每个梯度做两个培养皿.3、40min内完成。内完成。微生物显微计数微生物显微计数-血球计数板法血球计数板法一、实验目的一、实验目的1.了解血球计数板的构造和使用方法。了解血球计数板的构造和使用方法。2.学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。二、实验原理二、实验原理v利用血球计数板在显微镜下直接计数，利用血球计数

20、板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（行计数。由于计数室的容积是一定的（01mm2），所以可以根据在显微镜下观），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总

21、和，故又称为总菌计数法。和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。v 血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成大方格分成16个中方格，而每个中方格又

22、分成个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成个小方格；另一种是一个大方格分成25个中个中方格，而每个中方格又分成方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即数都是相同的，即1625=400小方格。小方格。每一个大方格边长为每一个大方格边长为1mm，则每一大方，则每一大方格的面积为格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为片与盖玻片之间的高度为01mm，所以，所以计数室的容积为计数室的容积为01mm3。在计数时，通常数五

23、个中方格的总菌数在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或或25，就得出一个大方格中的总菌数，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成然后再换算成1ml菌液中的总菌数。菌液中的总菌数。下面以一个大方格有下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀，菌液稀释倍数为释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数，那么，一个大方格中的总菌数因因1ml=1cm3=1000mm3，1ml 菌液中的总菌数菌液中的总菌数=A/5 2510000 B =50

24、000AB（个）（个）同理，如果是同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为方格的总菌数为A，则，则 1ml 菌液中的总菌数菌液中的总菌数=A/5 1610000 B =32000AB（个）（个）三三 器材器材酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。盖玻片，无菌毛细管。四、操作步骤四、操作步骤 1稀释稀释将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。浓，可不必稀释。2镜检计数室镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。在加样前，先对计数板的计数室进行镜

25、检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3加样品加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。满菌液。注意不可有气泡产生。4显微镜计数显微镜计数静止静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在

26、位置，然后换台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成成l酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。室中计得的值来计算样品的含菌量。5清洗血球计数板清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至

27、体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。干净为止。五、实验报告五、实验报告1结果结果将结果记录于下表中。将结果记录于下表中。A表示五个中方表示五个中方格中的总菌数；格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。表示菌液稀释倍数。2思考题思考题 根据你实验的体会，说明用血球计数板计数根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？，力求准确？实验四实验四 细菌的接种与培养细菌的接种与培养实验目的和要求实验目的和要求v学会正确使用常用的细菌接种工具，掌握学会正确使用常用的细菌接种工具，掌握细菌接种技术。细菌接种技

28、术。v熟悉细菌在不同培养基中的生长现象。熟悉细菌在不同培养基中的生长现象。v掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。实验内容实验内容v常用细菌接种工具的使用常用细菌接种工具的使用v琼脂平板划线分离培养法琼脂平板划线分离培养法v液体培养基接种法液体培养基接种法v斜面培养基接种法斜面培养基接种法v 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。种铲或接种锄、玻璃涂棒等。图6一、常用细菌接种工具的使用一、常用细菌接种工具的使用 接种工具接种工具 接种针和接种环：由三部分组组成，即环（针）、金属柄和绝缘柄。接种前后都要过火

29、灭菌。接种针用于穿刺接种细菌，接种环用于固体、液体培养基的细菌接种。涂布棒：用于琼脂平板涂布接种细菌。二、细菌接种的基本程序二、细菌接种的基本程序灭菌接种环灭菌接种环沾取标本沾取标本接种接种灭菌接种环灭菌接种环杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境三、接种方法三、接种方法1.斜面接种法：斜面接种法：用于鉴定和保存菌种。v材料：材料：菌种：菌种：葡萄球菌葡萄球菌 培养基培养基：肉汤琼脂斜面培养基：肉汤琼脂斜面培养基 其他：其他：接种环、酒精灯等接种环、酒精灯等方法方法1双手洗净，擦干，再用双手洗净，

30、擦干，再用75%酒精酒精棉球棉球擦拭双手擦拭双手。2当手上的酒精挥发完毕后，点燃当手上的酒精挥发完毕后，点燃 酒精灯。注意：一定要酒精灯。注意：一定要等手上的等手上的 酒精挥发完毕后，再点燃酒精酒精挥发完毕后，再点燃酒精 灯灯，否则，容易将手烧伤。，否则，容易将手烧伤。3接种，操作程序见下图。接种，操作程序见下图。注意：整个实验操作注意：整个实验操作过程都要非常小心，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。过程都要非常小心，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。（1）用左手大姆指、食）用左手大姆指、食指和无名指夹住菌种试管指和无名指夹住菌种试管和待接种和斜面试管，右和待接种和斜面试管，右手拧松棉塞、不取下。手拧松棉塞、

31、不取下。（2）右手拿接种环，在）右手拿接种环，在火焰上烧灼灭菌，特别火焰上烧灼灭菌，特别是箍处。是箍处。（3）火焰边取下两个棉）火焰边取下两个棉塞，不能放下；烧灼管塞，不能放下；烧灼管口一周。口一周。（4）将接种环伸入试）将接种环伸入试管内，冷却后，轻轻管内，冷却后，轻轻挑取少量菌体，立即挑取少量菌体，立即将接种环抽出。将接种环抽出。（6）抽出接种环后，）抽出接种环后，烧管口，塞棉塞，烧管口，塞棉塞，接种环灭菌。接种环灭菌。（5）火焰旁火焰旁将沾有菌种的将沾有菌种的接种环迅速伸到斜面培养接种环迅速伸到斜面培养基的底部，由基的底部，由里向外画蛇里向外画蛇形细线，形细线，线要画得细些。线要画得细些

32、。4熄灭酒精灯。熄灭酒精灯。5接种完毕，将所接接种完毕，将所接菌种菌种、接种日接种日 期期、接种者姓名填写在标签上接种者姓名填写在标签上。6、培养、培养 将接种后的试管放入恒温箱将接种后的试管放入恒温箱内，在内，在37下培养下培养24h。7、结果记录、结果记录 2.液体培养基接种法液体培养基接种法 可观察细菌在培养基中的生长现象或用作生化反应实验。v材料：材料：菌种：菌种：大肠杆菌大肠杆菌 培养基培养基：肉汤培养基（液体）：肉汤培养基（液体）其他：其他：接种环、酒精灯接种环、酒精灯v方法：方法：用用接种环接种环挑取斜面菌种送入培养挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻液中，使环

33、在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。将接种环烧红灭菌。3.平板划线接种法平板划线接种法：v目的：目的：使混合的细菌呈单个分使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。获得纯菌。v材料：材料：菌种：菌种：大肠杆菌和葡萄球菌的大肠杆菌和葡萄球菌的混合菌液混合菌液 培养基培养基：肉汤琼脂平板培养基：肉汤琼脂平板培养基 其他：其他：接种环、酒精灯接种环、

34、酒精灯v方法：方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本。连续划线法：适用于含菌量较少的标本。选用选用分区划线法分区划线法第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环连续划线法连续划线法 操作：（操作：（1 1）平板的制作平板的制作 加热培养基，当其冷至加热培养基，当其冷至4545左右时，右手拿装有培养基的锥左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后

35、将培养皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，轻摇培养皿，使培平放在桌上，轻摇培养皿，使培养基铺满皿底，待其冷凝后即成养基铺满皿底，待其冷凝后即成平板。平板。v（2 2）划线：）划线：右手拿接种环右手拿接种环挑取一环样品，挑取一环样品，左手拿培养皿左手拿培养皿，中，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，将将接种环接种环伸入培养皿内，先在培养基的一边作伸入培养皿内，先在培养基的一边作第一次第一次平平行划线行划线3 34 4条，再条，再转动培养皿转动培养

36、皿约约60600 0角，并将接种环上角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次第二次划线会，同法依次作划线会，同法依次作第三次划线第三次划线。划线完毕，盖上皿。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。盖，倒置于温室培养。切勿划破培养基！切勿划破培养基！（细菌的纯种分离平板划线法）v接种完毕，将所接菌种、接种日期、接种者接种完毕，将所接菌种、接种日期、接种者姓名填写在标签上。姓名填写在标签上。v将上述已接种细菌的培养基将上述已接种细菌的培养基倒置倒置，置于，置于3737恒温培养箱中孵育恒温培养箱中孵育181824h24h，观察细菌的生长，观

37、察细菌的生长现象。现象。培养基倒置培养基倒置v防止培养基的水分蒸发防止培养基的水分蒸发，特别是培养基倒得比较，特别是培养基倒得比较少时，更容易干掉，影响微生物生长。少时，更容易干掉，影响微生物生长。v防止防止形成的冷凝水滴落在培养基上，造成形成的冷凝水滴落在培养基上，造成染菌染菌。v倒放可以在某种程度上防止菌落蔓延，好倒放可以在某种程度上防止菌落蔓延，好形成形成单单个个菌落菌落，利于计数。，利于计数。实验流程实验流程融化固体培养基融化固体培养基倒平板倒平板液体培养基接种液体培养基接种固体培养基接种固体培养基接种培养培养结果记录：结果记录：微生物的菌落特征微生物的菌落特征 斜面斜面平板平板结果记

38、录结果记录v 1、液体培养基、液体培养基v 菌名v在液体培养基中的生长情况v 2、平板分区划线分离v菌名v大小v形状v表面v边缘湿润度透明度色素n3、斜面培养基：用文字描述细菌在斜面培养基上的生长现象菌落特征描写方法参考v 大小：大，中大小：大，中,小小,针尖状针尖状v 形态：圆形，不规则等形态：圆形，不规则等v 干湿情况：干燥，湿润，粘稠干湿情况：干燥，湿润，粘稠v 高度：扁平，隆起，凹下高度：扁平，隆起，凹下v 透明度：透明度，半透明，不透明透明度：透明度，半透明，不透明v 颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，黑色等黑色等v 边缘

39、：整齐，不整齐边缘：整齐，不整齐1、细菌在、细菌在固体固体培养基中的生长现象培养基中的生长现象v菌落菌落 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。v菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。堆积物。菌落与菌苔菌落与菌苔菌落菌落菌苔菌苔2、细菌在、细菌在液体液体培养基中的生长现象培养基中的生长现象v混浊混浊v沉淀：多见于链状排列的细菌。沉淀：多见于链状排列的细菌。v菌膜：多见于厌氧菌。菌膜：多见于厌氧菌。细菌在液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中的生长现象菌

40、膜菌膜菌沉淀菌沉淀均匀浑浊均匀浑浊对照对照细菌培养结果观察细菌培养结果观察v1、平板分区划线分离法、平板分区划线分离法:填填P17表格表格v2、液体培养基接种法：填、液体培养基接种法：填P18表格表格 先摇前观察，再摇后观察。先摇前观察，再摇后观察。v3、斜面培养基接种法、斜面培养基接种法 文字描述：细菌在斜面培养基上的生长现象文字描述：细菌在斜面培养基上的生长现象 (颜色、湿润度、边缘是否光滑等颜色、湿润度、边缘是否光滑等)。实验五实验五 细菌的芽孢染色法细菌的芽孢染色法 实验目的实验目的v学习并掌握细菌芽孢染色的原理和方法学习并掌握细菌芽孢染色的原理和方法 v 细菌的细菌的芽孢是芽孢是某些

41、细菌的某些细菌的特殊结构特殊结构。v 芽孢是某些细菌生长到一定阶段在体内形成的一个圆形或芽孢是某些细菌生长到一定阶段在体内形成的一个圆形或椭圆形的椭圆形的休眠体休眠体，它对不良环境具有很强的，它对不良环境具有很强的抗性抗性。在合适。在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。v 芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴定细菌鉴定细菌的重要的重要依据。在一般实验室中通常用依据。在一般实验室中通常用芽孢染色法芽孢染色法来观察其形态。来观察其形态。v 此外，由于芽孢具有很强的抗性，因此在生产实践中都以此外，由于芽孢具有很

42、强的抗性，因此在生产实践中都以是否有杀死抗性最强的芽孢是否有杀死抗性最强的芽孢来评定高温灭菌及某些化学杀来评定高温灭菌及某些化学杀菌剂的菌剂的效果效果。v 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。明状）。v 利用芽孢和菌体对染料亲和力不同的原理，用不同的染料利用芽孢和菌体对染料亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色。进行着色。v 芽孢壁厚，通透性低，着色脱色比较困难。因此，当先用芽孢壁厚，通透性低，着色脱色比较困难。因此，当先用

43、孔雀绿孔雀绿在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，也可以进入芽孢。进入菌体的染料可经水洗脱色，而体，也可以进入芽孢。进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以渗出，若再用进入芽孢的染料则难以渗出，若再用沙黄沙黄复染，此时复染，此时菌体菌体即被染成即被染成红色红色，而，而芽孢芽孢难着色，仍呈难着色，仍呈绿色绿色。实验原理实验原理实验材料实验材料v试管菌种试管菌种：枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌的斜面菌种的斜面菌种v试剂试剂：二甲苯、香柏油、蒸馏水、：二甲苯、香柏油、蒸馏水、5%孔孔雀绿水溶液、雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液沙黄水溶液v器材器

44、材：显微镜、接种环、酒精灯、载玻片：显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管（、盖玻片、小试管（16.5）、烧杯（）、烧杯（300ml）、试管架、电炉）、试管架、电炉实验步骤实验步骤v1 清洗玻片清洗玻片：將玻片用：將玻片用洗衣粉洗衣粉洗净，晾干洗净，晾干 制备涂片制备涂片：加：加1滴生理盐水于玻片上，用接种环从斜面上滴生理盐水于玻片上，用接种环从斜面上挑取挑取23环的菌苔于生理盐水并充分打匀，干燥、固定。环的菌苔于生理盐水并充分打匀，干燥、固定。加染色液加染色液：加：加5%孔雀绿孔雀绿水溶液水溶液35滴于已固定的涂片上滴于已固定的涂片上。加热加热：用木夹子夹住玻片在火焰上加热，使染料：

45、用木夹子夹住玻片在火焰上加热，使染料冒蒸汽冒蒸汽（但不沸腾），切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。加但不沸腾），切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。加热时间从热时间从冒蒸汽开始计算冒蒸汽开始计算约约45min。脱色脱色：倾去染液，待玻片冷却后：倾去染液，待玻片冷却后水洗水洗至孔雀绿不再褪色为至孔雀绿不再褪色为止。止。复染复染：用：用沙黄沙黄染液，复染染液，复染23min，倾去染色液，倾去染色液，水洗。，水洗。镜检镜检：待干燥后，置于油镜下观察。：待干燥后，置于油镜下观察。结果观察与记录结果观察与记录v如实如实地、地、按比例按比例地地绘图绘图;v说明枯草杆菌说明枯草杆菌菌体的形状菌体的形状、

46、芽孢的形状芽孢的形状及及其其着生位置着生位置。注意事项注意事项v供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在芽孢囊内。巨大芽孢杆菌在芽孢仍保留在芽孢囊内。巨大芽孢杆菌在3737条条件下以培养件下以培养12122424小时的效果最佳。小时的效果最佳。v用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则，应用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太小。菌体沉于管底，涂片时菌体太小。蜡

47、样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌 梭型芽孢杆菌梭型芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌实验二实验二 细菌染色法细菌染色法一、目的要求一、目的要求掌握革兰氏染色法的原理及操作步骤。掌握革兰氏染色法的原理及操作步骤。二、基本原理二、基本原理 细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结使菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，从而有利于对细菌标本的观察。构，从而有利于对细菌标本的观察。细菌染色法可分为单染色法和复染色法两大类。细菌染色法可分为单染色法和复染色法两大类。革兰氏染色法原理革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用

48、的重要革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（革兰氏阳性菌（G G+）和革兰氏阴性菌（）和革兰氏阴性菌（G G-）两大）两大类。类。革兰氏染色是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏染色是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏革兰氏阳性菌阳性菌的的细胞壁肽聚糖层厚细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结

49、果使细胞呈紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现现紫色。紫色。革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂含量较高，网状结构交联少，而且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细胞壁被脱色，再经蕃红复染后细与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细胞壁被脱色，再经蕃红复染后细胞呈胞呈红色红色。革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较成分成分 占细胞壁干重的占细胞壁干重的%革蓝氏阳性菌革蓝氏阳性菌 革蓝氏阴性

50、菌革蓝氏阴性菌肽聚糖肽聚糖 含量很高（含量很高（50-9050-90）含量很低（含量很低（1010）磷壁酸磷壁酸 含量较高（含量较高（5050）无无类脂质类脂质 一般无（一般无（22）含量较高（含量较高（2020）蛋白质蛋白质 无无 含量较高含量较高革兰氏染色的意义革兰氏染色的意义v细菌分类鉴定细菌分类鉴定v指导临床用药指导临床用药三、实验器材三、实验器材1 1、菌种、菌种:大肠杆菌与葡萄球菌的混合菌液。大肠杆菌与葡萄球菌的混合菌液。2 2、染液、染液 革兰氏染液革兰氏染液3 3、其他物品：、其他物品：显微镜、载玻片、香柏油、擦显微镜、载玻片、香柏油、擦镜纸、酒精灯、接种环、蒸馏水、染色架。镜