感染性疾病的分子诊断.课件.ppt

1、DNADNAmRNA蛋白质蛋白质转录转录反转录反转录 翻译翻译 核酸分子杂交核酸分子杂交 基因结构异常基因结构异常基基 因因 表表 达达 异异 常常PCR DNADNA测序测序 核酸分子杂交核酸分子杂交 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR 反转录反转录PCRPCR 蛋白质芯片蛋白质芯片 ELISA 蛋白组织化学染色蛋白组织化学染色 Western-blot 基因芯片基因芯片 基因诊断的技术和方法基因诊断的技术和方法 第四代：分子诊断（第四代：分子诊断（1978年始）年始） 病因学诊断病因学诊断 分子诊断分子诊断基因病类型基因病类型1 1、感染性疾病：、感染性疾病： 病原生物的侵入如流感、肝炎

2、、艾滋病病原生物的侵入如流感、肝炎、艾滋病2 2、遗传性疾病：、遗传性疾病： 如苯丙酮尿症、血友病等如苯丙酮尿症、血友病等3 3、复杂性疾病、复杂性疾病，如肿瘤、原发性高血压，如肿瘤、原发性高血压 一般性检出策略和方法一般性检出策略和方法 针对特异性的核酸序列进行核酸分子探针针对特异性的核酸序列进行核酸分子探针杂交杂交，或者利用常规，或者利用常规PCRPCR技术直接检出微生物的技术直接检出微生物的DNA/RNADNA/RNA，判断有无感染和是何种病原体感染。，判断有无感染和是何种病原体感染。完整检出策略和方法完整检出策略和方法 按照诊断按照诊断分型分型亚型亚型耐药性检测的思耐药性检测的思路，利

3、用多种基因诊断手段对感染性病原体进路，利用多种基因诊断手段对感染性病原体进行分析。行分析。一、分子诊断策略一、分子诊断策略二、分子诊断方法二、分子诊断方法1.信号放大技术信号放大技术（bDNA杂交捕获系统）杂交捕获系统）支链支链DNA（bDNA）技术）技术杂交捕获系统杂交捕获系统特点：特点：稳定性、重复稳定性、重复性、特异性好性、特异性好二、分子诊断方法二、分子诊断方法2.靶分子扩增技术靶分子扩增技术（PCR/TAS/LCR）转录依赖的扩增系统（转录依赖的扩增系统（TAS）连接酶链反应（连接酶链反应（LCR）特点：特点：简单、快速、简单、快速、灵敏度高灵敏度高1.标本选择标本选择选择原则：选择

4、原则：符合疾病的发病机制，反映病程符合疾病的发病机制，反映病程标本类型：标本类型：血浆、血清、全血或白细胞血浆、血清、全血或白细胞核酸类型：核酸类型：DNARNAmiRNA三、标本处理三、标本处理2.标本量、抗凝剂标本量、抗凝剂3.标本保存、传送标本保存、传送4.标本预处理标本预处理1.阴性结果阴性结果注意：注意：灵敏度灵敏度,核酸提取及扩增效率核酸提取及扩增效率.四、结果解释四、结果解释2.阳性结果阳性结果3.定性检测结果定性检测结果4.疾病状况的判断疾病状况的判断注意：注意：特异性特异性,可能的污染可能的污染.注意：注意：病情缓解患者病情缓解患者.1.弥补血清学诊断缺陷弥补血清学诊断缺陷注

5、意：注意：窗口期窗口期,灵敏度灵敏度,部分特殊病例部分特殊病例.五、应用及评价五、应用及评价2.不能培养或生长缓慢微生物不能培养或生长缓慢微生物3.监测疾病状态监测疾病状态4.耐药性及分型检测耐药性及分型检测第二节第二节 病毒基因检测病毒基因检测乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBVHBV）、人乳头瘤病毒）、人乳头瘤病毒（HPVHPV）：）：其其DNADNA可以使用点杂交、可以使用点杂交、PCRPCR方法直接检出方法直接检出。丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCVHCV）、人免疫缺陷病毒）、人免疫缺陷病毒（HIVHIV）：）：其其RNARNA可以使用可以使用RT-PCRRT-PCR方法直接检出方法直接

6、检出。HBVHBV基因组结构基因组结构pre-s1pre-s2SP PC Cpre-cX乙乙 肝肝pre-S1 pre-S1蛋白蛋白pre-S2 pre-S2蛋白蛋白S HBsAgpre-C HBeAgC HBcAgP DNAPX HBxAg乙型肝炎病毒基因结构模式乙型肝炎病毒基因结构模式分子诊断：分子诊断：信号放大技术；信号放大技术；PCR法；耐药性检测法；耐药性检测1.弥补血清学检测结果弥补血清学检测结果,诊断诊断HBV临床意义临床意义2.缩小窗口期缩小窗口期,快速诊断快速诊断3.定量检测定量检测,指导病情指导病情4.检测耐药检测耐药,指导用药指导用药丙型肝炎丙型肝炎(HCV)(HCV)基

7、因诊断实例基因诊断实例丙型肝炎为丙型肝炎为RNARNA病毒，病毒，9500mer9500mer，编码，编码3011-30333011-3033个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：E1NS2NS3NS43-NCRCNS1/E2NS5B5-NCR高变异区（编码衣壳和包膜蛋白）（NCR: 非编码区） 5-NCR5-NCR为保守的区域，将引物设计在该区域，为保守的区域，将引物设计在该区域，进行进行RT-PCR, RT-PCR, 可特异性的扩增可特异性的扩增HCVHCV。分子检测方法：分子检测方法：1.HCV的的RNA定性及定量检测定性及定量检测 RT-PCR, 巢式

8、PCR,定量PCR,转录依赖的 扩增系统（如TAS）,分支DNA(bDNA) 2. HCV基因分型鉴定基因分型鉴定测序、real-time PCR等 1.监测临床疗效监测临床疗效临床意义临床意义2.缩小窗口期缩小窗口期,快速诊断快速诊断3.定量检测定量检测4.免疫缺陷补充检测免疫缺陷补充检测H1N1甲型流感 实验室检查 外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低； 血清学诊断：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等； 分子诊断？分子诊断策略分子诊断策略第三节第三节 病原菌的基因检测病原菌的基因检测耐药菌株的监测耐药菌株的监测: :

9、结核分支杆菌耐药基因结核分支杆菌耐药基因rpoBrpoB金黄色葡萄球菌耐药基因金黄色葡萄球菌耐药基因MRSAMRSA确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日至2009年2月22日，发现651例，来自43个州，死亡8例病例-对照调查：与花生酱相关，尤其某些花生酱饼干流行病学和实验室调查发现源头为一个工厂生产的花生酱和花生糊，这些产品同时也是多家食品生产厂家的中间材料。确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日至2009年2月22日，发现651例，来自43个州，死亡8例病例-对照调查：与花生酱相关，尤其某些花生酱饼干流行病学和实验室调查发现源头为一个工厂生产的花生酱和花生糊，这些产品

10、同时也是多家食品生产厂家的中间材料。冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品前增菌法前增菌法25gBPW225mL36 1 一般4h，干蛋品18h24h10mLMM（或（或TTB）100mL10mLSC100mL直接增菌法直接增菌法25g灭菌生理盐水灭菌生理盐水25mL检样匀液检样匀液25mL MM（或（或TTB）100mL检样匀液检样匀液25mL SC100mLBSDHL（或（或HE、WS、SS）TSI（排除（排除A/A H2S结果结果 ），靛基质，尿素，靛基质，尿素，KCN，赖氨酸，赖氨酸沙门氏菌血清学试验沙门氏菌血清学试验甘露醇 山梨醇H2S 靛靛 尿尿KCN 赖赖H2S 靛靛 尿尿KCN 赖赖/非如左述的各种反应结果非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验沙门氏菌血清学试验 ONPG 沙门氏菌沙门氏菌非沙门氏菌非沙门氏菌42 18h24h36 1 18h24h42 18h24h36 1 18h24h36 1 40h48h36 1 18h24h 微生物学检验微生物学检验 沙门氏菌检验沙门氏菌检验中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准GB/T 4789.4-2003PCR快速检测快速检测致食物中毒的细菌致食物中毒的细菌