免疫学检测技术PPT课件1.ppt
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1、1 免疫学检测技术免疫学检测技术.2第一节第一节 体外抗原抗体结合反体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素应的特点及影响因素3一一. . 体外抗原抗体反应的特征体外抗原抗体反应的特征 高度特异性:高度特异性:抗原的表位与抗体的抗原结合抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。点结构互补。 表面化学基团之间的可逆性结合表面化学基团之间的可逆性结合适宜的抗原抗体浓度和比例适宜的抗原抗体浓度和比例抗原抗体反应的两个阶段抗原抗体反应的两个阶段4高度专一性的结合高度专一性的结合5可逆性结合可逆性结合Equivalence Lattice formation6抗原抗体比例对反应现象抗原抗体比例对反应现象的影响的
2、影响7抗原抗原抗体反应的抗体反应的影响因素影响因素电解质:可促进抗原与抗体的结合。电解质:可促进抗原与抗体的结合。 常用生理盐水。常用生理盐水。温度温度:最适温度为:最适温度为37。酸碱度酸碱度:最适:最适p pH =6-8。8第二节第二节 检测抗原或抗体的检测抗原或抗体的体外试验体外试验9(一)凝集反应(一)凝集反应 颗粒性抗原(颗粒性抗原(RBCRBC、细菌等)与相应抗体、细菌等)与相应抗体 结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。1 1直接凝集试验直接凝集试验玻片凝集试验:用于玻片凝集试验:用于定性测抗原定性测抗原。如。如ABOABO血型鉴定,血型鉴定,细
3、菌的鉴定、分型等。细菌的鉴定、分型等。试管凝集试验:用于试管凝集试验:用于定量测抗体定量测抗体,如肥达氏反应。如肥达氏反应。 2 2间接凝集试验间接凝集试验 如类风湿因子的测定等。如类风湿因子的测定等。1011(二)二)沉淀反应沉淀反应 可溶性抗原(可溶性抗原(血清蛋白、组织浸液等)与血清蛋白、组织浸液等)与 相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。 因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行,故因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行,故 又称为又称为琼脂扩散试验或免疫扩散琼脂扩散试验或免疫扩散。 12琼脂凝胶琼脂凝胶131单向免疫扩散单向免疫扩散 用于用于定量测抗原定量测
4、抗原。 如检测血清免疫球蛋白、如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。等含量。 142 2双向免疫扩散双向免疫扩散 主要用于主要用于定性检测抗原或抗体,抗原组成及两定性检测抗原或抗体,抗原组成及两 种抗原相关性分析种抗原相关性分析153 3免疫电泳免疫电泳 其方法是其方法是先电泳、后扩散。主要用于先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析抗原成分的分析,亦可,亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断 16(三)免疫标记技术(三)免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术 =抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性标记免疫技术的
5、主要特点:标记免疫技术的主要特点:高特异性高特异性、高灵敏性高灵敏性免疫技术免疫技术 + 标记技术标记技术17常用的标记物常用的标记物181)免疫酶测定法免疫酶测定法 (Enzyme Immunoassay, EIAEIA)p利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法或抗体的方法p特点:利用抗原特点:利用抗原- -抗体反应的高度特异性,抗体反应的高度特异性,以及酶催化底物反应的生物放大作用以及酶催化底物反应的生物放大作用, , 最后用酶标仪测定光密度值(最后用酶标仪测定光密度值(ODOD),评),评定抗原定抗原- -抗体的含量。抗体的含量。19常用酶及其底
6、物常用酶及其底物辣根过氧化物酶(辣根过氧化物酶(HRPHRP)碱性磷酸酶(碱性磷酸酶(APAP) 20分类21双抗体夹心法双抗体夹心法在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等等 22特点:特点:v非竞争结合反应非竞争结合反应v常用于抗原的检测常用于抗原的检测v适用于分子中具有至少两个抗原决定簇适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测的检测v所用两种抗体分别针对同一个抗原分子所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原
7、决定簇的不同抗原决定簇 23间接法间接法ELISAELISA乙肝标志物中乙肝标志物中抗抗HBs的检测的检测常采用本法常采用本法 242 )免疫荧光技术免疫荧光技术 (Immunofluorescence Technique) 25常用荧光素常用荧光素 异硫氰酸荧光素(异硫氰酸荧光素(FITC),), 显黄绿色。显黄绿色。 藻红蛋白(藻红蛋白(PE),显红色。),显红色。用途:细胞表面用途:细胞表面CD分子分子 抗核抗体抗核抗体 262728293 )放射免疫测定法(放射免疫测定法(RIA)p敏感度可达敏感度可达pgpg水平,水平, 其标记物为其标记物为125125I I、131131I I等。
8、等。p常用于常用于微量物质的检测微量物质的检测,如激素、,如激素、IgEIgE等。等。 304 )发光免疫分析发光免疫分析 (luminescence immunoassay LIA)u将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量免疫分析技术。免疫分析技术。u优点:该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的优点:该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的高灵敏度。高灵敏度。 31p化学发光免疫测定化学发光免疫测定吖啶酯、鲁米诺吖啶酯、鲁米诺p生物发光免疫测定生物发光免疫测定萤火虫、发光水母萤火虫、发光水母p化学发光酶免疫测定化
9、学发光酶免疫测定辣根过氧化物酶(辣根过氧化物酶(HRPHRP)碱性磷酸酶(碱性磷酸酶(APAP)p电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定325 )免疫胶体金技术免疫胶体金技术336 )免疫印迹法免疫印迹法(Western blottingWestern blotting) 该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术,即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体,技术,即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体,再用酶免疫、放射免疫技术测定。再用酶免疫、放射免疫技术测定。 常用于常用于检测多种蛋白质检测多种蛋白质3435364.蛋白质芯片技术:蛋白质芯片技术:又称蛋白质微阵列又
10、称蛋白质微阵列是一种高通量的蛋白功能分析技术,可用于蛋白质表达谱是一种高通量的蛋白功能分析技术,可用于蛋白质表达谱分析,研究蛋白质与蛋白质的相互作用,甚至分析,研究蛋白质与蛋白质的相互作用,甚至DNA蛋白蛋白质、质、RNA蛋白质的相互作用,筛选药物作用的蛋白靶点蛋白质的相互作用,筛选药物作用的蛋白靶点等。等。37原理:原理:是将各种是将各种蛋白质蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片,然后,用标记了有特定荧光物质的载体上成为检测的芯片,然后,用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用,与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对抗体与芯片作用,与芯片上的蛋白质相
11、匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合,抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表应的蛋白质结合,抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。达数量。38第三节第三节 免疫细胞功能的检测免疫细胞功能的检测 3940免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离41( (一一) )外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)包括淋巴细胞和包括淋巴细胞和单核细胞
12、(单核细胞(monocyte)。)。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞,是一种单次差速密度梯度离心的分离法。胞,是一种单次差速密度梯度离心的分离法。 42细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同43不同细胞密度不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的密度为单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的密度为1.075-1.090 44
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